Dentigerumycin: a gombaellenes szimbiózis bakteriális közvetítője

Absztrakt

A gombatermesztéses hangyák kölcsönös kapcsolatba lépnek mind az élelmiszerként termesztett gombával, mind az aktinobaktériumokkal (Pseudonocardia spp.), amelyek szelektív antibiotikumokat termelnek, hogy megvédjék a gombát a speciális gombás parazitáktól. Elemeztünk egy ilyen rendszert molekuláris szinten, és megállapítottuk, hogy a baktérium társul a hangyához Apterostigma dentigerum nagy mértékben módosított aminosavakat tartalmazó ciklikus depsipeptidet tartalmazó dentigerumicint állít elő a kapcsolódó parazita gomba szelektív gátlására (Escovopsis sp.).

A baktérium izolálásával kezdtük (Pseudonocardia sp.), a gombafajta és a parazita gombaEscovopsis sp.) hangyától (Apterostigma dentigerum) fészket gyűjtöttek Gamboában, Panamában 2001-ben (CC011120-4 telepkód, lásd Supplementary Methods online; 1a. ábra). Az Pseudonocardia törzsét izoláljuk a kutikulából A. dentigerum erősen gátolja a Escovopsis ugyanabból a telepből nyert izolátum (1b. ábra), míg a gombafajta viszonylag ellenáll a baktériumtörzsnek (1. kiegészítő ábra online). A teljes folyékony tenyészet etil-acetátos extraktumának és az agar lemez tenyészet metanolos kivonatának kezdeti LC/MS-analízise Pseudonocardia törzs egyetlen fő komponens jelenlétét tárta fel (2. kiegészítő ábra online). További vizsgálatok, amelyek kiterjedt tenyésztéssel (8 liter) és a vizsgálattal vezérelt frakcionálással C18 flash-oszlopon és HPLC-n keresztül megerősítették, hogy ez a fő vegyület, amelyet dentigerumycinnek neveztünk (1, ÁBRA. (2a) bekezdésének felelõs Escovopsis gátlás.

közvetítője

(a) Apterostigma gombatenyésztő hangya (kolóniakód: CC011120-4), amely a Apterostigma dentigerum. (b) A páros kihívás biológiai vizsgálata bizonyítja in vitro a parazita gomba gátlása Escovopsis (felül és alul) Pseudonocardia (középen) (8,5 cm átmérőjű agarlemez).

(a) A dentigerumicin szerkezete (1) erősen módosított aminosav egységeket tartalmaz, például piperazinsavakat. (b) A fogékonyság dózis-válasz görbe ábrázolja a dentigerumycin log koncentrációját μM-ben, szemben a gombasejtek sűrűségével (fluoreszcencia egység). Escovopsis, a parazita gomba dentigerumycin általi gátlását bizonyítja, amelynek MIC-értéke 2,8 μM. A hibasávok mutatják az s.d.

A dentigerumicint fehér por formájában izoláltuk, amelynek molekulaképlete C40H67N9O13, nagy felbontású ESI-TOF tömegspektrometriával meghatározva, 1H és 13C NMR spektrális adatokkal kombinálva (1. kiegészítő táblázat és 3. kiegészítő ábra online). Az 1H-NMR-spektrum 9,50 ppm-nél 1 downfield szingulett protont, 2 amid dublett protont és 12 protont 4 és 6 ppm között mutatott. A 13C-NMR- és gHSQC-spektrumok 7 amid- vagy észter-karbonil-szenet, 5 oxigéntartalmú szenet, 9 nitrogéntartalmú szenet és 19 alifás szén-szignált mutattak. A gHSQC spektrális adatok elemzése lehetővé tette az összes egykötésű szén- és protonkorreláció hozzárendelését, és kilenc protont azonosított a heteroatomokhoz.

A gCOSY, TOCSY, gHSQC és gHMBC NMR spektrumok értelmezése hat aminosavból származó szubstruktúrát és egy poliketid eredetű szubstruktúrát rendelt. Ezek közé tartozik két piperazinsav egység (Pip-1 és Pip-2), γ-hidroxipiperazinsav (γ-OH-Pip), β-hidroxi-leucin (β-OH-Leu), N-hidroxi-alanin (N-OH-Ala), alanin és egy piránt tartalmazó acil oldallánc (2a. Ábra és kiegészítő 4a. Ábra online). A legfontosabb HMBC összefüggések biztosították az aminosav egységek és az acil oldallánc szekvenciáját (Kiegészítő 4b. Ábra), amelyek kiegészítették a dentigerumycin síkbeli szerkezetét (2a. Ábra). Meghatároztuk a dentigerumycin sztereokémiáját spektroszkópiai elemzés, lebontó reakciók és derivatizációk kombinációjával, az alábbiakban leírtak szerint. A pirángyűrű relatív konfigurációját az acil oldalláncban a ROESY korrelációk határozták meg (online 5a. Kiegészítő ábra). A β-OH-Leu két egymást követő sztereogén központjának relatív konfigurációját 23-ként állapítottuk megS * és 24S * által .-alapú konfigurációs elemzés 8 (Kiegészítő 5b. ábra). A γ-hidroxi-piperilsav relatív konfigurációját az (5S *, 7S *) -γ-OH-Pip 1H-1 H kapcsolási állandóval és ROESY spektrális elemzéssel 9 (5c. kiegészítő ábra).

Mert szabad N-Az OH-Ala várhatóan nem reagált az FDLA-val, mi átalakítottuk N-OH to N-H a dentigerumycin TiCl3-mal történő kezelésével (lásd a kiegészítő módszereket) 14. Ezt a konverziót a redukciós termék 1H, gCOSY, TOCSY, gHSQC és gHMBC NMR-jével (3. kiegészítő ábra) igazoltuk (8.) és nagy felbontású tömegspektrum-analízissel (2. kiegészítő táblázat online). A termék (8.) hidrolizáltuk, L-FDLA-val derivatizáltuk és LC/MS-sel elemeztük a korábban leírtak szerint egy 15S konfiguráció.

Meghatároztuk az acil oldallánc abszolút konfigurációját a C29 és C30 hőmérsékleten lévő 1,2-diol Mo2 (OAc) 4 komplexének CD spektrális elemzésével (lásd Kiegészítő módszerek). A 15. empirikus szabály alapján a dentigerumycin komplexnek, amelynek negatív jele van az indukált CD-spektrumban, 29S és 30R konfigurációk, ha az 1,2-diol molekula elfogadja az előre jelzett alacsony energiájú konformációját (Kiegészítő 7. ábra online). Ez az eredmény 33-at is megállapítottS és 34R konfigurációk a korábban meghatározott relatív sztereokémiájuk alapján.

A piperazinsavak kémiai származékképzése különösen nagy kihívást jelent 9, és abszolút konfigurációikat főként röntgenkristályográfiával állapították meg. A flash hidrolízis, a fejlett Marfey és a módosított Mosher módszerek kombinációja általánosan alkalmazható megközelítést nyújt ezen egyre gyakrabban előforduló aminosavak jellemzésére.

A dentigerumicin egy korábban be nem jelentett depsipeptid, amely szokatlan aminosavakat tartalmaz - piperazinsavat, γ-hidroxi-piperazinsavat, β-hidroxi-lucint és N-hidroxi-alanin - egy pirángyűrűt tartalmazó poliketid eredetű oldallánccal együtt. A dentigerumycinhez leginkább hasonlító természetes termékek a 16 polioxipeptinek és az 17 aurantimycinek, amelyekben a dentigerumycinnel közös aminosavak vannak. Azonban nem azonos a mag szerkezetük, mint a dentigerumycin, mert a többi aminosav különbözik egymástól - ami a legfontosabb a dentigerumycinben található további piperazinsav egység révén, amely várhatóan nagyon eltérő magkonformációt eredményez. Mert mindezeket elszigetelték Streptomyces spp., valószínűleg egyes bioszintetikus elemeket megosztottak 18 .

Míg a Petri-csészés vizsgálatok azt mutatják, hogy a dentigerumycin egyértelműen jobban gátolja a parazita gombát, mint a tenyésztett gomba (8. kiegészítő ábra online), folyékony tenyésztési vizsgálatban kvantitatívan értékeltük minimális gátló koncentrációját (MIC = 2,8 μM) a Escovopsis parazita a CC011120-4 telepről (2b. ábra). A folyékony tenyészvizsgálat nem volt alkalmas a tenyésztett gombákra, mert folyékony tenyészetekben rendkívül lassan növekszik. A dentigerumicin szintén gátolta Candida albicans vad típus, C. albicans ATCC10231 és amfotericin-rezisztens C. albicans ATCC200955 1,1 μM MIC-értékekkel. Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a Apterostigma szimbiózis, mint a déli fenyőbogár-rendszerben, amelyet a 2,19-es mikangimicin, az ascomycete (Escovopsis sp.) érzékeny, míg a bazidiomycete (fajta) rezisztens.

Jegyzet: Kiegészítő információk és a kémiai vegyületekről szóló információk a Nature Chemical Biology weboldalon érhetők el.