Határok a táplálkozásban

Táplálkozás és élelmiszer-tudomány technológia

Szerkesztette
António M. Peres

Bragança Politechnikai Intézet (IPB), Portugália

Felülvizsgálta
Stefano Sforza

Parmai Egyetem, Olaszország

Armindo Melo

Gyógyszerésztudományi Kar, Porto Egyetem, Portugália

Joost Gouw

Nutricia Research (Hollandia), Hollandia

A szerkesztő és a lektorok kapcsolatai a legfrissebbek a Loop kutatási profiljukban, és nem feltétlenül tükrözik a felülvizsgálat idején fennálló helyzetüket.

diétás

  • Cikk letöltése
    • PDF letöltése
    • ReadCube
    • EPUB
    • XML (NLM)
    • Kiegészítő
      Anyag
  • Exportálás
    • EndNote
    • Referencia menedzser
    • Egyszerű TEXT fájl
    • BibTex
OSZD MEG

Eredeti kutatás CIKK

  • 1 Nemzeti Kutatási Tanács (CNR), Élelmiszertudományi Intézet, Avellino, Olaszország
  • 2 A Nápolyi Egyetem „Federico II” Transzlációs Orvostudományi Tanszéke, Nápoly, Olaszország
  • 3 CEINGE Advanced Biotechnologies, Nápolyi „Federico II” Egyetem, Nápoly, Olaszország
  • 4 Mezőgazdasági Tanszék, Parco Gussone, Nápolyi „Federico II” Egyetem, Portici, Olaszország
  • 5 Európai laboratórium az élelmiszer okozta betegségek kivizsgálására, Nápolyi „Federico II” Egyetem, Nápoly, Olaszország
  • 6 Mikrobiom-tanulmányi munkacsoport, „Federico II” Egyetem, Nápoly, Olaszország

Bevezetés

Az anyatej antigénileg aktív élelmiszer-allergéneket tartalmaz, amelyek az anya étrendjéből származnak (1). Ez az állítás főként az 1980-as és 90-es években végzett immunkémiai adatokon és klinikai vizsgálatokon alapul (4–6). Ezekben az években egyértelműen megállapították, hogy az anya étrendjéből származó ételallergének kiválthatják a mellékhatások klinikai megnyilvánulásait kizárólag szoptatott, fogékony újszülötteknél, 0,5% -os előfordulási gyakorisággal (7–10). Számos tanulmány dokumentálta az intakt ételallergének változó mennyiségének jelenlétét az anyatejben, beleértve az ovalbumint (11), a gliadint (12), a mogyorót (2, 13) és a tehéntej fehérjét (10). Az emberi anyatejben található ételallergénekről beszámoltak arról, hogy a koncentrációk nagyon széles tartományában változnak, alig valamivel 0,1 és> 1000 ng/ml között (3), de valószínűleg az alacsony ppb (ng/ml) szintek a legreálisabb adatok (14).

Az anyatejben a tehéntej allergének keresése lelkes kutatások tárgyát képezte. A humán és a szarvasmarha β-kazeinjének, az a1-kazeinnek és az a-laktalbuminnak közepes vagy magas fokú szekvencia homológiája van (53, 31, illetve 73% homológiája), és ezáltal bizonyos immun keresztreaktivitás. Ezért a β-laktoglobulint (β-Lg), amelyet az emberek nem expresszálnak, gyakran tehéntejjel jelöltek. Az immunokémiai adatok szerint úgy tűnik, hogy az étrendi ételallergének anyatejbe történő kiválasztódását jelentősen befolyásolja az egyéneken belüli és egyénen belüli variabilitás (11, 14–16). A tehéntej-allergénekre különös tekintettel, az exogén β-Lg-t csak korlátozott számú anyatej-mintában detektálták, és jelenléte nem függ össze atópiás vagy nem atópiás állapotokkal (15). A teljes laktációs periódus alatt végzett longitudinális vizsgálatban a 25 egészséges donortól kapott 232 (azaz 40%) anyatejmintából 93 tartalmazott kimutatható mennyiségű étrendi β-Lg-t (16). Csak két anyának volt kimutatható β-Lg az összes tejmintájában, míg hat anya teje egyetlen esetben sem tartalmazta. Nemrégiben Matangkasombut et al. (17) arról számolt be, hogy az étrendi β-Lg még a tehéntej elfogyasztása után is 7 napig perzisztens volt az emberi tejben.

Schocker és mtsai. (23) kétdimenziós elektroforézist/Western blot és MS felhasználásával vizsgálta a hidrolizálatlan Ara h 2 és más mogyoróallergének anyatejbe jutását. Érdekes, hogy kompetitív ELISA-val vizsgálták az emberi tejmintákat is annak érdekében, hogy számszerűsítsék a földimogyoró-fehérjékből származó emésztés-rezisztens peptideket.

Először használtuk fel az MS-t a szarvasmarha-kazein és tejsavófehérjék emésztéséből származó peptidek kimutatására a szoptató donorok anyatejébe választva tehéntej szájon át történő beadása után (24). Különösen szarvasmarha β-Lg és αs1-kazein fragmenseket mutattak ki két, illetve hat anyatej-minta 12% -os triklór-ecetsavval (TCA) oldható frakciójában. Ezzel szemben a nagy felbontású/érzékenységű MS által azonosított β-Lg peptidek megúszták a nem frakcionált tejen végzett kompetitív ELISA tesztet, ami arra utal, hogy nagyon alacsony bőséggel fordulhatnak elő. A várakozásoknak megfelelően a szigorú tej- és naplómentes étrendnek megfelelő, hat szoptató nőtől kapott kontroll tejmintákból hiányoztak a tehéntejből származó peptidek. Az intakt β-Lg hiánya kimutatható mennyiségben bármely anyatej-mintában nátrium-dodecil-szulfát-poliakrilamid gélelektroforézissel (SDS-PAGE) és a 12% TCA-ban oldhatatlan fehérjepellet Western blot-analízisével igazoltuk. Nemrégiben Zhu al. (25) MS-adatok alapján magas szintű kurátort kapott az emberi tejben lévő nem humán peptidekről, és a tehéntejből származó peptidek voltak a legreprezentáltabb fajok.

Ebben a tanulmányban az étkezési tehéntej-peptidek lehetséges intra-variabilitásának monitorozását tűztük ki célul az emberi tejben. Erre a célra szarvasmarha tejből származó peptideket céloztunk meg az egyetlen donortól vett anyatejben, különböző napokon a megfelelő orális tehéntej-terhelés előtt és után. Ezenkívül ugyanazon szoptató anyától vettek anyatejet 6 órán keresztül (öt időponttal) a tehéntej elfogyasztása után. Janssen Duijghuijsen et al. (26) elegánsan kiemelte annak lehetőségét, hogy a változó hosszúságú élelmiszer-eredetű peptideket a testfolyadékokban lévő endogén antitestek megfogják. Így a 12% TCA-ban oldódó frakció mellett az oldhatatlan fehérje pellet triptikus emésztését elemeztük HPLC-MS/MS alkalmazásával.

Anyagok és metódusok

Ditiotreitolt (DTT), jód-acetamidot (IAA), guanidint, trifluor-ecetsavat (TFA), ammónium-hidrogén-karbonátot (Ambic), Tris-bázist, EDTA-t és más vegyszereket a Sigma-Aldrich-től (St. Louis, MI, USA) vásároltunk. HPLC-MS minőségű oldószereket Carlo Erba-tól (Milánó, Olaszország) szereztünk be. A pozitív kontrollok előállításához használt szarvasmarha tej-tejsavófehérje-izolátumot a Fonterra Dairy Co.-tól szereztük be. az új-zélandi Riddett Intézeten keresztül.

Mintavétel

Műanyag eldobható szivattyúkészlettel ellátott mellszivattyún keresztül összesen 18 anyatej mintát (5 ml) nyertek. A mintákat szülés után a laktáció második és harmadik hónapjában gyűjtöttük egy nem atópiás, egészséges donortól (28 éves), aki szülés után szállított. Anyatej minták (

200 ml szájon át pasztörizált szarvasmarha-tejet követően különböző napokon 2 és 3 óra között gyűjtöttük. A tejet műanyag steril csövekbe fejeztük ki, összekevertük egy szerin-proteáz inhibitorral (Pefabloc®, Sigma, St. Louis, MI, USA, 1 mM végkoncentráció), és a nem kívánt hidrolízis megakadályozása érdekében azonnal -20 ° C-on lefagyasztották.

A donortól 5 különböző napon összegyűjtött anyatej mintákon kezdeti szűrést végeztek. Ezeket a mintákat D1, D2, D3, D4 és D5 jelöléssel láttuk el. A szoptató anya szigorú étrendet követett el, amely legalább 1 hétig tehéntejtől és tejelőtől mentes volt. Összességében 10 mintát nyertek és elemeztek külön-külön az anyatej összegyűjtésével a csecsemő etetése előtt és után minden egyes mintavételi napon. A D sorozat mintáit két példányban futtattuk. Három kontroll tejmintát (alapvonalat) gyűjtöttek, mielőtt az anyának tehéntejet adtak volna.

Miután értékelte a szarvasmarha tejből származó peptidek jelenlétét az anyatejben, további mintákat vettek ugyanattól az anyától. Ebben az esetben az anyatejet 6 órás időközönként, időközönként (1, 2, 3, 4 és 6 óra) gyűjtöttük szájon keresztüli szarvasmarhatej után. Ezeket a mintákat T0 (alapvonal), T1 (1 óra), T2 (2 óra), T3 (3 óra), T4 (4 óra) és T5 (6 óra) formában terveztük, és HPLC-MS/MS módszerrel elemeztük. hármas. A nápolyi „Federico II” Egyetem (Olaszország) Fordítói Orvostudományi Tanszékén jártas szakember felügyelte a szarvasmarhatej adminisztrációját, a mintagyűjtést és a kódcímkézést. A tejminták összegyűjtése előtt írásbeli, tájékozott beleegyezést kaptak az anyától.

Peptid extrakció

Az anyatej-minták alikvot részeit centrifugálással (3 000 x g 15 percig, 4 ° C-on) fölözöttük, és a felső zsírréteget spatulával eltávolítottuk (ezt kétszer megismételtük). A fölözött tej fehérjéit 4 ° C-on kicsaptuk 12% (w/v) triklór-ecetsav (TCA) végső koncentrációval, és centrifugálással (4500xg 30 percig 4 ° C-on) pelletáltuk. A 12% TCA-ban oldódó peptideket (250 μl) szilárd fázisú C18 reverz fázisú centrifugáló oszlopokkal extraháltuk (Pierce Biotechnology, Rockford, IL, USA), alaposan 0,1% trifluor-ecetsavval (TFA) mostuk és 70% acetonitrillel eluáltuk. 0,1% TFA-t tartalmazó AcN). Az AcN-t SpeedVac ™ párologtató rendszerben elpárologtattuk, és a peptideket végül liofilizáltuk.

A fehérjepellet triptikus hidrolízise

Annak érdekében, hogy a TCA-t eltávolítsuk a maradék pelletből, a csapadékot hideg acetonban (-20 ° C) újraszuszpendáljuk, és 4500 x g-vel 30 percig 4 ° C-on háromszor centrifugáljuk. Végül 5 mg szárított fehérjeport feloldunk 1 ml denaturáló/redukáló pufferben (6 M guanidin-HCl, 0,3 M Tris, 1 mM EDTA, 10 mM DTT, pH 8,0), és 56 ° C-on inkubáljuk 1 órán át. . Ezután a ciszteineket IAA-val (55 mM végkoncentráció) alkilezzük 40 percig szobahőmérsékleten, sötétben. A sztöchiometrikus mennyiségű DTT-t alkalmaztuk az IAA-felesleg csillapítására. A Cys-alkilezett fehérjéket (50 μl alikvot) 10-szeresére hígítottuk 25 mM ammónium-hidrogén-karbonáttal (AMBIC) pH = 7,8 mellett, és egy éjszakán át emésztettük 37 ° C-on tripszinnel 1:50 enzim/szubsztrát arányban w). A kapott peptideket C18 reverz fázisú centrifugáló oszlopok segítségével tisztítottuk és liofilizáltuk a HPLC-MS/MS elemzés előtt.

Versenyképes ELISA a β-Lg fragmensekhez

Adatbázis keresés és peptid azonosítás

Az LC-MS/MS nyers adatokat a MaxQuant szoftvercsomag Andromeda eszközével elemeztük (1.6.2.10 verzió). A kereséseket taxonómiailag korlátozták Homo sapiens és Bos taurus az Uniprot adatbázisban (frissítve 2017 novemberében). Ezt követően a kereséseket finomították egy manuálisan elkészített fehérje adatbázis felhasználásával, amely a proteomalapú vizsgálatokból levezetett 30 leggyakoribb tehéntej génterméket tartalmazta (27, 28). A 12% TCA-ban oldódó peptidek elemzéséhez a keresési feltételek között szerepelt a nem specifikus hasítás, nincs statikus módosítás, Met oxidáció, piroglutaminsav az N-terminális Gln-nél és a Ser/Thr foszforilezés, mint változó módosítások.

A fehérjepelletek elemzéséhez a tripszint választották proteolitikus enzimként, legfeljebb két elmaradt hasítással, és statikus módosításként karbamidometil-ciszteint is bevontak. A pelletekből származó peptidek elemzését nem specifikus hasítás körülményei között is megismételtük annak érdekében, hogy azonosítsuk az anya emésztéséből fakadó és az anyatej antitestekkel összefüggő lehetséges szarvasmarha tejből származó peptideket. A tömegtűrés értéke minden esetben 5 ppm volt a prekurzor ionnál és 10 ppm az MS/MS fragmenseknél. A peptidspektrum-egyezéseket (PSM) a cél csali adatbázis megközelítéssel szűrtük, e-értékük 0,01 peptidszintű hamis felfedezési arány (FDR) volt, ami 99% -os megbízhatósági pontszámnak felel meg. Mivel jelentős átfedés van az emberi és a szarvasmarha tejfehérje szekvenciák között, szükség volt az adatok további finomítására a két proteomhoz illeszkedő peptidek azonosításával. A szarvasmarha- és az emberi szekvenciának egyaránt megfelelő peptideket eltávolítottuk a végleges eredménylistából. Csak a viszonylag bőséges szarvasmarha-tejfehérjékből származó peptidek kerültek be az azonosított szarvasmarha-peptidek listájába.

Eredmények

Az endogén proteázok intenzív aktivitása miatt az emberi tej eredendően gazdag oligopeptidekben (29), amelyek megzavarják az anya étrendjéből származó lehetséges idegen peptidek nyomának MS-alapú kimutatását. Noha a tehéntejből származó peptidek keresése gyakorlatilag csak kevés bőséges fehérjére korlátozódik (kazein és főbb tejsavófehérjék), nincs lehetőség arra, hogy megjósolják, mely peptidek ürülhetnek ki az anyatejbe, mivel a fehérjebontás szempontjából a hasítási specifitás lényegesen hiányzik. az anya testének pre- és postabszorpciós fázisaiban. Így a rendszer analitikai bonyolultsága megköveteli a „mély” és a „nem célzott” peptidomika kombinációját, amely csak a legmodernebb fejlett peptidomikai megközelítések alkalmazásával kezelhető. Ez a bonyolultság elfogadható okot adna arra is, hogy miért nem vagy alig tettek kísérletet az élelmiszer-allergén eredetű peptidek kimutatására az emberi tejben.

Diétás tehéntej-peptidek anyatejben

3. ábra. Példaértékű munkafolyamat a β-kazein f (81–92) peptid azonosítására a T2 anyatej mintában. (A) A 12% TCA-ban oldódó peptidek HPLC MS/MS TIC kromatogramja; (B) MS1 spektrum retenciós időben (RT) 109,0–109,2 perc. A B panel betétje nagyított képet mutat, amely tartalmazza az m/z 660.88 jelet (*); (C) A m/z jel 660,88 MS/MS spektruma a β-kazein f (81–92) szignálfragmensek hozzárendelésével. Az étrendi eredetű peptid egy kisebb MS-jel, amely nagyon alacsony kromatográfiás csúcsokban található, és jelzi az anyatejben tapasztalható kevés relatív mennyiségét.

Ezért a tejből származó peptidek szignáljai legalább 3,5–4 nagyságrenddel (5 × 10 3–10 4-szeres) voltak kevésbé intenzívek, mint az anyatej leggyakoribb endogén peptidjei (intenzitás az 1,7–2,9 × 10 10 tartomány), amely komolyan megkérdőjelezi az MS módszer dinamikus tartományát.

Ezek az eredmények azt mutatták, hogy az anyai étrendből származó peptidek nagyon alacsony mennyiségben fordulnak elő az anyatej endogén peptidjeihez képest, amelyek viszont csak az emberi tej fehérje/polipeptid tartalmának a töredékét képviselik.

E vizsgálat kvantitatív adatai az exogén peptiddúsítások bruttó becslését mutatják be. Pontos relatív mennyiségi meghatározást a T-sorozatú minták között úgy érhetünk el, hogy a peptideket stabil izotóp címkékkel jelöljük, amelyek kis tömegű riporter fragmenseket generálnak (például iTRAQ módszer). Az étrendi peptidek abszolút mennyiségi meghatározása külön tanulmányt igényel, megfelelő szabványokkal, és mintánként kell elvégezni, az emberi tej polipeptid-frakciójának összetételbeli változékonysága miatt (25). Annak ellenére, hogy az étkezési fehérjék a hagyományos osztályozás szerint „gyorsak” (tejsavófehérjék) és „lassúak” (kazeinek), relatív emésztési és felszívódási sebességük alapján (34), a korán megjelenő peptidek mind a kazeinből, mind a tejsavófehérjékből származnak. Ez arra utal, hogy a két fehérjecsalád hidrolitikus fragmensei meglehetősen gyorsan emészthetők, eloszthatók és kiválasztódhatnak az anyatejbe.

Dot-Blot elemzés

A D-sorozatú anyatej minták dúsított és tisztított 12% -ban TCA-ban oldódó peptid frakciójában a β-Lg-származékú peptideket pont-blot analízissel céloztuk meg. Valamennyi minta peptidkivonatait egyértelműen felismerte az anti-β-Lg antitest, hasonlóan a pozitív kontrollként használt szarvasmarha-savófehérjék kimotriptiás emésztéséhez (4. ábra). Ezzel szemben a tehéntej szájon át történő bevitele előtt összegyűjtött anyatej-alapminták nem voltak immunreaktívak, ezáltal kizárva az endogén tejfehérjékből származó peptidekkel való lehetséges keresztreakciót. Az immunreaktív foltok intenzitása nem volt korrelálható a HPLC-MS/MS által kimutatott β-Lg-eredetű peptidek számával és ionintenzitásával, mivel az esetleges immunreaktív β-Lg polipeptidek elkerülhetik az MS elemzést.

4. ábra. Az immunreaktív β-Lg peptidek Dot-Blot kimutatása a D-sorozatú anyatej minták 12% -ban TCA-ban oldódó frakciójában. A kiindulási (BL) minták az anyatej peptid-kivonatai voltak, amelyeket a tehéntej orális terhelése előtt nyertek. A H-β-Lg a pozitív kontrollként alkalmazott β-Lg kimotriptiás emésztése volt.

Versenyképes ELISA

A β-Lg peptidek számszerűsítésére tett kísérletünk során az összes anyatej mintát megvizsgáltuk egy kompetitív ELISA teszttel, amelyet kifejezetten a natív β-Lg és a származék peptidek feldolgozott élelmiszer-mátrixokban történő meghatározására fejlesztettek ki. A standard β-Lg oldatok köbös spline görbére illeszkednek, a gyártó útmutatásainak megfelelően. Az anyatejminták egyike sem tartalmazott kimutatható β-Lg peptideket a deklarált kimutatási határértéknél (2,1 ppm), ami megerősíti korábbi eredményeinket (24). A kompetitív ELISA érzékenysége valószínűleg nem volt megfelelő a β-Lg peptidek kimutatására, amely valószínûleg alacsony ppb mennyiségnél fordul elõ, a relatív MS jelintenzitáson alapuló bruttó becslés szerint. Az ELISA-val vizsgált kevésbé hígított anyatej-minták (azaz 1/50 és 1/100) következetlen eredményeket adtak a mátrixinterferencia miatt. Az ELISA-alapú módszerek általában hamis pozitív és hamis negatív eredményekhez vezethetnek, ha a komplex élelmiszer-mátrixokban az allergének nyomának meghatározására alkalmazzák, ami hangsúlyozza az antigén-antitest felismerésre nem támaszkodó analitikai módszerek szükségességét (35).

Tehéntej-peptidek keresése a fehérjepelletben

A testnedvekben, különösen a vérben vagy az anyatejben lévő étrendi polipeptideket antitestek vehetik fel, vagy nem specifikus interakciók révén fehérjékhez társulhatnak. Egy ilyen eredmény megmagyarázhatja azt is, hogy az ELISA-módszerekkel miért nem sikerült kimutatni az MS által feltárt fehérjetöredékeket (26). Az anyatejben hordozó antitestekkel vagy fehérjékkel kapcsolatos lehetséges ép tehéntejfehérjék vagy étkezési peptidek megcélzása érdekében a 12% TCA-ban oldhatatlan fehérjepelletet Cys-redukcióval/alkilezéssel denaturáló pufferben (6 M guanidin) és az ebből származó triptikus emésztésekkel elemzését HPLC-MS/MS módszerrel végeztük. A tehéntej fehérje szekvenciákat tartalmazó adatbázisban mind a tripszin hasítási specifitását, mind a nem specifikus hasítást használtuk. Mintánként átlagosan csaknem 400 endogén fehérjét azonosítottak nagy bizalommal (1% FDR, e Kulcsszavak: anyatej, tehéntej fehérjék, ételallergének, fehérjeszemésztés, HPLC-MS/MS, Western blot, β-laktoglobulin, szoptatás

Idézet: Picariello G, De Cicco M, Nocerino R, Paparo L, Mamone G, Addeo F és Berni Canani R (2019) Diétás tehéntejből nyert peptidek kiválasztása anyatejbe. Elülső. Nutr. 6:25. doi: 10.3389/fnut.2019.00025

Beérkezett: 2018. december 20 .; Elfogadva: 2019. február 20.;
Publikálva: 2019. március 12.

António Manuel Peres, Bragança Politechnikai Intézet, Portugália

Armindo Melo, Portói Egyetem, Portugália
Stefano Sforza, Parmai Egyetem, Olaszország
Joost Gouw, Nutricia Research, Hollandia