A kalória stressz megváltoztatja a tej tulajdonságait és a Hsp70 expressziót a tejelő szarvasmarha tehenek tej szomatikus sejtjeiben

Harel Eitam

1 Állattudományi Intézet, Kérődzők Tudományának és Genetikájának Tanszéke, Newe Ya’ar Kutatóközpont, Agrárkutatási Szervezet, P.O. Box 1021, Ramat Yishay, 30095, Izrael

2 Evolúciós és Környezetbiológiai Tanszék, Természettudományi és Természettudományi Kar, Haifai Egyetem, Haifa, 31905 Izrael

Arieh Brosh

1 Állattudományi Intézet, Kérődzők Tudományának és Genetikájának Tanszéke, Newe Ya’ar Kutatóközpont, Agrárkutatási Szervezet, P.O. Box 1021, Ramat Yishay, 30095, Izrael

Alla Orlov

1 Állattudományi Intézet, kérődzők tudományának és genetikájának tanszéke, Newe Ya’ar Kutatóközpont, Agrárkutatási Szervezet, P.O. Box 1021, Ramat Yishay, 30095, Izrael

Ido Izhaki

3 Evolúciós és Környezetbiológiai Tanszék, Természettudományi és Természettudományi Kar, Haifai Egyetem, 31905 Haifa, Izrael

Ariel Shabtay

1 Állattudományi Intézet, kérődzők tudományának és genetikájának tanszéke, Newe Ya’ar Kutatóközpont, Agrárkutatási Szervezet, P.O. Box 1021, Ramat Yishay, 30095, Izrael

Absztrakt

Bevezetés

A mediterrán térségben, valamint a világ számos országában a húsmarha-állományokat kiterjedt rendszerben termesztik. A mediterrán ökoszisztémákat az erőforrások rendelkezésre állásának magas szezonalitása különbözteti meg (Sternberg et al. 2000). Ez azt jelenti, hogy a szabadon legelésző húsmarhák kémiai összetevői, emészthetősége és anyagcseréje révén csökkenthetik a takarmány táplálkozási minőségét, különösen a meleg és száraz évszakokban (Aharoni et al. 2004; Brosh et al. 2004), amelyek legfeljebb 8 hónapig tarthat (Main 1986).

A rossz minőségű takarmány káros hatással lehet a szaporodásra (Randel 1990), és a tejtermelésre gyakorolt káros hatása révén a borjak elválasztási sikerét is akadályozhatja. Izraelben az elmúlt két évtizedben valóban megfigyelhető a szabadon legelő húsmarha-állományok borjúnövény-termelésének folyamatos jelentős csökkenése (Ungar et al. 2005). Mivel a csökkent energiafogyasztás lerövidíti az időtartamot, és hátrányosan befolyásolja a teljes tejhozamot a laktációs időszak alatt (Jenkins és Ferrell 1992), és meghosszabbítja az elléstől az első szülés utáni ivarzásig tartó időszakot (Randel 1990), nagyon valószínű, hogy a folyamatos csökkenés a borjúnövénytermesztésben a takarmány minőségének csökkenése a tejelő tejelő tehenek tejjellemzőire gyakorolt káros hatásaiból származhat.

A tejelő szarvasmarháknál is előfordulhat kalóriatörzs (ketózis). A ketózis az ellést követő első 2 hónapban fordul elő, és súlyos negatív energiaegyensúly okozza, amely a magas tejtermelésből, az elégtelen energiafogyasztásból és a testzsír túlzott mozgósításából fakad (de Roos et al. 2007). Az elmúlt évszázadokban a tejelő teheneket magas tejhozam mellett választották ki, függetlenül a szoptató borjú tényleges táplálkozási igényeitől. A hús- és tejelő tehenek kalórias stresszre és/vagy ketózisra adott reakcióinak összehasonlításával nyomon követhető, hogy a tejjellemzők változásai tükrözik-e azokat az evolúciós mechanizmusokat, amelyek révén a laktató tehenek megküzdöttek az élőhelyük táplálkozási kihívásaival.

Sejtszinten a 70-es hősokk-fehérje (Hsp70) indukciója összefüggött a kalóriatűrés toleranciájának kialakulásával (Kregel 2002). A Hsp70 a Hsp szuper család tagja, amely gyors, specifikus és masszív szintézissel segíti az organizmusokat a különféle stresszek kezelésében (Craig és Lindquist 1988; Welch 1990). Ennek a Hsp családnak a tagjai azonban konstitutív módon jelen vannak a sejtekben. Az indukált és a konstitutívan expresszált Hsp családok jól ismertek molekuláris chaperonokként, amelyek segítenek a különféle polipeptidek normális hajtogatásában, segítik a rosszul összehajtogatott fehérjéket natív állapotuk elérésében vagy visszanyerésében, szabályozzák a fehérje lebomlását és segítik a fehérjék transzlokációját a különböző sejtrészekben (Hartl és Hayer-Hartl 2002; Kovacs et al. 2005).

A húsmarhák tejtermelését tekintik a borjak növekedési sebességére gyakorolt anyai hatások fő meghatározójának az elválasztásig (Meyer et al. 1994). A tej nagymértékben befolyásolja a borjú teljesítményét és a gát táplálkozási szükségleteit, így közvetett módon befolyásolja az újratenyésztési arányokat is (Mallinckrodt et al. 1993).

A fentiek fényében elkerülhetetlen egy olyan fiziológiai és molekuláris index kidolgozása, amely a szabadon legeltetett laktató marhahúsok kalórias stresszre gyakorolt reakciójának tesztelésére szolgál, mind a produktív, mind az önvédelem szintjén. Egy ilyen index nagy segítség lehet, amikor a húsmarha-fajták táplálkozási szempontból kihívást jelentő élőhelyekre való alkalmasságának tesztelésére kerül sor. Jelen tanulmány a tejelő tejelő tehenek kompenzációs válaszaira összpontosít az alacsony energia- és fehérjetartalmú étrend hosszú távú bevitelére a tejtermelés és jellemzők (tartalom, zsírsavösszetétel) és a tejszomatikus sejtek génexpressziójának tanulmányozásával. Ezen válaszok egy részét (tejhozam, zsírsavösszetétel és fehérje expresszió a tej szomatikus sejtjeiben) összehasonlítjuk a ketotikus tehenészetekkel.

Anyagok és metódusok

Állatok és kezelések

2. kísérlet A ketózis tejelő tehenek tejzsírjellemzőire gyakorolt hatásának tanulmányozásához friss kontroll tejből mintát vettünk hat kontroll és tíz ketotikus Holstein - fríz tehénből egy kereskedelmi tejgazdaságból (Kibutz Yifat). Az utómarás, a kontroll és a ketotikus teheneket azonos táplálékkal etettük, ME - 2,78 Mcal/kgDM és CP - 18% -kal, amelyek 51% -a lebontható. A ketotikus állapotot állatorvos határozta meg a vizelet keton testének elemzésével. Ezt követően tejmintákat gyűjtöttünk. Az állatokkal kapcsolatos összes eljárást az izraeli állatgondozási és kísérleti bizottság hagyta jóvá.

Tejhozamok

A folyamatos (3 hónapos) LEP étrend hatásának feltárására a marhahús tehenek tejtermelési potenciáljára vonatkozóan meghatároztuk a tejhozamot a mérés-szívás-mérés technikával. Ez a technika az egyik leggyakrabban idézett módszer a tejtermelés mérésére, és bizonyos korlátozások ellenére hasonló eredményt lehet meghatározni, ha azt egy fejőgéppel összehasonlítjuk (Benson et al. 1999). A teheneket és a borjakat 16 órával a mintavétel előtt elválasztották. A szoptatás előtti és utáni borjútömeg közötti különbség, 24 órás alapra igazítva, becslést adott a tehén napi tejtermelésére. A szoptató esemény körülbelül 30 percig folytatódott, miután a borjakat bevezették gátjaikba.

Tejtartalom

A kontroll és a 3 hónapos kalória- és fehérje (CAP) korlátozással rendelkező tehéntejek kézzel fejett tejmintáit a közepes infravörös spektroszkópos módszerrel elemeztük zsír-, fehérje-, karbamid- és laktóztartalom szempontjából (Milkoscan FT6000; Foss Food Technology Corp. (DK; AOAC 1990). A szomatikus sejtszámot a Fossomatic 5000 FC-vel (Foss Food Technology Corp., DK) határoztuk meg.

Tej zsírsavösszetétel

A tej szomatikus sejtjeinek feldolgozása

A marha- és tejelő tehenek friss tejéből származó szomatikus sejteket (150–200 ml) pelletáltuk centrifugálással 1000 × g-vel 10 percig, 4 ° C-on, 0,5 mM etilén-diamin-tetraecetsav (EDTA; végső koncentráció) jelenlétében, a kazein - zsír emulzió. A sejtpelletet háromszor (RNS extrakció esetén) öt (sejtprotein extrakció esetén) alkalommal mossuk hideg foszfáttal pufferolt sóoldattal (PBS) -EDTA (0,5 mM) a kazein és a zsírgömbök eltávolítása érdekében. Fehérjét és RNS-t extraháltak a szomatikus sejtekből a mintavételtől számított 30 percen belül. Addig a mintákat hűtött dobozban tartották.

Vérvétel

Vért vettünk a gátak farokvénájából, evakuált csövek (Greiner bio-one GmbH, Ausztria) segítségével, amelyek antikoagulánsként EDTA-t tartalmaztak. A vért 1000 × g-on, 4 ° C-on centrifugáltuk, hogy a sejteket elválasszuk a plazmától. A buffy bevonatot egy új, lehűtött Eppendorf-csőbe helyeztük. A megmaradt vörösvérsejteket vörösvérsejt-lizáló pufferrel távolítottuk el (Roche, 1-814-389. Számú kat.). A leukocitákat ezután hideg PBS-sel mossuk, és azonnal felhasználjuk a fehérje extrakciójához.

SDS-PAGE és Western blot

Az egészsejt-lizátumokat 2-merkaptoetanolt tartalmazó mintahordozó pufferben forraljuk. A fehérjéket nátrium-dodecil-szulfát-poliakrilamid-géllel (10%) elválasztottuk és nitrocellulóz membránokra vittük (Schleicher & Schuell Gmbh, Dassel, Németország). A membránokat monoklonális anti-aktinnal (Sigma, cat # A1978), anti-Hsp70-gyel (a fehérje konstitutív és indukálható formáinak felismerésével; Sigma H5147) és anti-Hsp90-gyel (Stressgen, SPA-830 macska) szondáztuk, majd megfelelő másodlagos antitestekkel. A fehérjéket fokozott kemilumineszcenciával tettük láthatóvá.

αs1-kazein azonosítás - tömegspektrometriás elemzés

A szomatikus sejtek fehérjekivonatait 10% -os akrilamid gélen futtattuk és Coomassie kékkel festettük. A festett fehérjeszalagokat, ~ 29 kDa molekulatömeggel, tiszta borotvapengével kivágtuk a gélből, és a fehérjéket 10 mmól -1 ditiotreitollal redukáltuk, és 100 mmól -1 jód-acetamiddal 10 mmóll-ben módosítottuk. −1 ammónium-hidrogén-karbonát. A géldarabokat 50% -os acetonitrillel kezeltük 10 mmol/1 ammónium-hidrogén-karbonát oldatban a folt eltávolítása céljából, majd a géldarabokat szárítottuk. A szárított géldarabokat 10% acetonitrillel 10 mmol/1 –1 ammónium-hidrogén-karbonát-oldatban, 0,005 μg · μl –1 tripszint tartalmazó rehidratáljuk, majd éjszakán át 37 ° C-on inkubáljuk. A kapott peptideket 60% acetonitrillel és 0,1% trifluor-acetáttal nyerjük ki. A triptikus peptideket reverz fázisú, nagy teljesítményű folyadékkromatográfiával oldottuk meg 0,1 × 300 mm-es kondenzált szilícium-dioxid-kapillárisokon (J&W, Folsom, CA, USA; 100 μm id), otthon töltve porózus R2-vel (Persepective, Framingham, MA, USA) ).

A peptideket 80 perc periódusú 5–95% acetonitril és 0,1% ecetsav vizes gradiens alkalmazásával ~ 1 μl · min -1 áramlási sebességgel eluáltuk. Az oszlopból származó folyadékot elektronspray-vel ioncsapda tömegspektrométerbe (LCQ; Finnigan, San Jose, Kalifornia, USA). A tömegspektrometriát (MS) pozitív ion módban hajtottuk végre, ismétlődő teljes MS letapogatással, majd az első MS vizsgálatból kiválasztott legdominánsabb ion ütközés által kiváltott disszociációjával (CID). A tömegspektrometriás adatokat összehasonlítottuk a fehérjék szimulált proteolízisével és CID-jével az NR-National Center for Biotechnology Information adatbázisban, a Sequest szoftver segítségével (J. Eng és J. Yates, Washingtoni Egyetem és Finnigan, San Jose, Kalifornia, USA). . A fehérje amino-terminálisát egy Peptide Sequencer 494A [Perkin Elmer, (Applied Biosystems), Foster City, CA, USA] szekvenáljuk a gyártó utasításainak megfelelően. Az αs1-kazein migrációját a gélben standard tiszta αs1-kazein futtatásával igazoltuk (Sigma).

RNS izolálás és RT-PCR

A teljes RNS-t a tej szomatikus sejtjeiből a gyártó ajánlása szerint a TRI REAGENT LS (MRC, Cincinnati, OH, USA Cat. # TS-120) alkalmazásával extraháltuk. A genomi DNS-szennyeződés eltávolítása érdekében a mintákat DNase-vel (Epicenter, kat.szám: DB0711k) kezeltük a gyártó ajánlása szerint. Az RNS koncentrációját Nano-Drop (ND-1000) módszerrel, valamint annak minőségét mértük. A teljes RNS minőségét ezenkívül nem-telítetlen agaróz gél segítségével is megbecsültük.

Az RNS-t -80 ° C-on tároltuk, vagy azonnal felhasználtuk a reverz transzkriptáz-polimeráz láncreakció (RT-PCR) reakciókhoz a Verso cDNS Kit (Thermo Fisher Scientific Inc., Cat # AB1453/A) felhasználásával. A T-Personal PCR gépet (Biometra) az alábbiak szerint programoztuk: 42 ° C 60 percig az RT lépéshez, majd 95 ° C 2 percig és az amplifikációs lépések 94 ° C 2 percig, 60 ° C 40 másodpercig és 72 ° C-on 1:30 percig. Elkészítettünk egy mesterkeveréket, és alikvotizáltuk kémcsövekhez, mindegyiket 30 ciklusig amplifikáltuk.

Ábra összehasonlító RT-PCR reakcióit. A 3. reakciót két primerpár alkalmazásával hajtottuk végre ugyanabban a reakcióelegyben: FABP3 esetében a forward primer TTCGTGGGTTCCTGGAAG és a fordított primer CGAGTGCAAACTGCAGTG egy 367 bp méretű fragmentumot amplifikált, míg a Cytokeratin19 esetében az előremozdító AGATGACTTCCGCACCAAGT bp és a reverse. A CD45 esetében az előre mutató példa az ATGTATCTGTGGCTTAAAC volt, míg a fordított példa a CATTACACT TGAATTGTCC volt. A hőkezelési hőmérséklet kivételével, amely 49 ° C volt, a CD45 amplifikálására szolgáló PCR-program megegyezett a fentiekkel.