A metformin nem befolyásolja elhízott egereknél a veleszületett légúti túlérzékenységet és az ózonra adott válasz fokozódását

Absztrakt

az elhízás az asztma kockázati tényezője. Több keresztmetszeti vizsgálat felnőttek és több etnikai háttérrel rendelkező gyermekek nagy populációiban azt mutatja, hogy az elhízott és túlsúlyos egyéneknél nagyobb az asztma prevalenciája. Ezenkívül számos nagy prospektív tanulmány azt mutatja, hogy az elhízás megelőzi az asztmát (lásd a közelmúltbeli áttekintéseket a 16., 61. és 63. hivatkozásban). Az elhízott, súlycsökkenő asztmás betegek kevesebb asztmás tünetet, megnövekedett légáramlási sebességet, csökkent csúcsáram variabilitást és jobb asztmás kontrollt eredményeznek (21, 43, 68). Az elhízás szintén hatással van az asztma kontrolljára és egyes asztmás gyógyszerek hatékonyságára (13, 36, 51, 55).

A biguanid metformin orális inzulinérzékenyítő szer, amelyet általában a 2-es típusú cukorbetegség kezelésében alkalmaznak. A metforminnal végzett kezelés javítja az elhízott egerek diabéteszes fenotípusát is, csökkentve az éhgyomri glükózt és gyengítve a májban a glükoneogén enzimek expresszióját (7, 17, 18, 23, 39, 70). Emberi alanyokban a metformin gyengíti az elhízással járó szisztémás gyulladás aspektusait is (4, 10–12, 20). Jelen vizsgálat célja annak meghatározása volt, hogy a hiperglikémia hozzájárul-e az elhízott egerek tüdőfenotípusához. Ennek megfelelően a sovány vad típusú és elhízottakat kezeltük db/db egerek orálisan vízzel vagy metforminnal minden nap 2 hétig. Két metforminnal és vízzel kezelt egeret használtunk. Az egyik kohorszban a légúti reakciókészséget 24 órával az utolsó kezelés után értékelték annak megállapítására, hogy a metformin képes-e csökkenteni a db/db egerek. A másik kohorszban, az utolsó metformin- vagy vízkezelés után 24 évvel, az egereket hevesen O3-nak tették ki [2 ppm (ppm) 3 órán át], és megvizsgálták az ebből következő gyulladásos választ.

Állatok.

Ezt a tanulmányt a Harvard Orvosi Terület Állatok Állandó Bizottsága hagyta jóvá. Elhízott nőstény db/db és ob/ob az egereket a The Jackson Laboratory-tól (Bar Harbor, ME) vásároltuk. Mivel ezek az egerek C57BL/6J háttérrel rendelkeztek, vad típusú, életkornak megfelelő és nemhez illeszkedő C57BL/6J egereket használtunk kontrollként. Az egerek mindkét típusa hiperfágikus, hipometabolikus, hiperinsulinémiás, hiperglikémiás és masszívan elhízott (37). A metformin kezelés szérum glükóz hatásosságának igazolására mindkettőt használtuk ob/ob és db/db egerek. Minden más kísérlethez használtuk db/db csak egerek.

Jegyzőkönyv.

Az elhízott és sovány egereknek vizet vagy metformint (300 μg/g) adagoltak szondával naponta 2 hétig. Mások az éhomi vércukorszint csökkenéséről számoltak be db/db egerek hasonló kezelési protokollal (17, 18). Három kohort használtunk. Egy kohorszban, az utolsó kezelés után, ob/ob és db/db az egereket egy éjszakán át éheztettük az éhomi vércukorszint mérésére a Prestige Smart System IQ vércukormérővel (Home Diagnostics, Fort Lauderdale, FL) (4 metforminnal és 4 vízzel kezelt egérrel). A második kohorszban, 24 órával az utolsó kezelés után, az egereket altattuk a légúti reakciókészség mérésére, majd szérumot gyűjtöttünk a szisztémás gyulladás értékelésére (n = Csoportonként 6–8 egér). Ne feledje, hogy nem tudtuk katéterezni a vénát a metakolin egy egérbe történő bejuttatásához, de ennek ellenére egérben szívszúrás útján vérmintát gyűjtöttünk. Az utolsó kohorszban az egereket O3-nak tettük ki (2 ppm 3 órán át) 24 órával az utolsó szoptatás után. Négy órával az expozíció után az egereket eutanizálták, és bronchoalveoláris mosást (BAL) hajtottak végre (n = 5-6 egér/csoport).

O3 expozíció.

Az ébren lévő egereket fékezés nélkül, egyedi dróthálós ketrecekben helyeztük el egy rozsdamentes acél és plexi expozíciós kamrában, és O3-nak tettük ki (2 ppm 3 órán át), ahogy azt korábban leírtuk (29, 66). Az O3 expozíciós protokollt úgy választottuk meg, hogy összehasonlíthassuk más kutatók adataival, akik egerekben akut O3-indukálta gyulladást tanulmányoztak (5, 6, 25, 27, 49, 56, 72), beleértve db/db egerek (41). Ez a koncentráció magasabb, mint az emberi expozícióhoz alkalmazott tipikus koncentráció. Az O3 belélegzett dózisa azonban nemcsak az ózonkoncentráció és az expozíciós idő szorzata, hanem a percenkénti szellőzés is (75). Az emberi expozíciót általában olyan személyeknél végzik, akik a percenkénti szellőzésük növelése érdekében gyakorolnak (3). Ezzel szemben az egerek az anyagcserében mélyen csökken az O3-expozíció hatására, és 2 ppm O3-nál percenkénti szellőzésük az expozíció előtt mért értékek csak egyharmadára csökken (64). Ennélfogva, bár az emberi és egér-vizsgálatokhoz használt koncentrációk jelentősen eltérhetnek, az ózon tényleges belélegzett dózisa valószínűleg sokkal összehasonlíthatóbb.

Tüdőmechanika.

A szabadon nem látható egereket xilazinnal (7 mg/kg) és pentobarbitál-nátriummal (50 mg/kg) altattuk. A légcsövet tubulusadapterrel kanüláltuk, és a farokvénát kanülöltük acetil-β-metilkolin-klorid (metakolin; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) bejuttatásához. Az egereket speciális ventilátorral (flexiVent; SCIREQ, Montreal, QC, Kanada) szellőztettük. A frekvenciát vad típusú és 180 Hz-en állítottuk be db/db egerek, ill. A programhoz használt valamivel magasabb frekvencia db/db az egereket azért választottuk, mert ezek az egerek spontán, nagyobb gyakorisággal lélegeznek, de megközelítőleg ugyanolyan árapálytérfogattal, mint a vad típusú egerek (41). Ezért az árapály térfogatát mindkét törzsben 0,3 ml-re állítottuk be. A mellkas falának mindkét oldalán egy nagy ablak készült úgy, hogy elvágta néhány borda egy részét és a közöttük lévő szövetet. Így a tüdőt többnyire légköri nyomásnak tették ki, és az elvégzett mérések csökkentették a mellkasfal bármilyen hatását a tüdőmechanikában. A kilégzési vonal víz alá helyezésével 3 cmH2O pozitív kilégzési nyomást alkalmaztunk.

Mi és mások beszámoltunk arról, hogy a ZL valós és képzeletbeli részei a frekvencia függvényében jól megfelelnek ennek a modellnek ezen a frekvenciatartományon belül (24, 53, 54).

Bronchoalveoláris mosás.

Négy órával az O3 expozíció leállítása után az egereket eutanizáljuk pentobarbitál-nátrium túladagolásával. A légcsövet kanüláltuk, és a tüdőt kétszer átmostuk 1 ml PBS/0,6 mM EDTA-val. A BAL-t centrifugáltuk, és az összes BAL-sejtet és a differenciálist az előzőekben leírtak szerint értékeltük (28–30, 32). A BAL felülúszót -80 ° C-on fagyasztottuk, majd keratinocita eredetű kemokin (KC), makrofág gyulladásos fehérje 2 (MIP-2), interferon-indukálható 10 fehérje (IP-10), LPS által indukált CXC kemokin (LIX) elemzésére került sor. ) és monocita kemoattraktáns fehérjét 1 (MCP-1), DuoSet enzimhez kapcsolt immunszorbens assay (ELISA) készletekkel (R&D Systems, Minneapolis, MN). Ezeket a neutrofil kemotaktikus faktorokat azért választottuk, mert jellemzően akut O3 expozíció indukálja őket, és mert beszámolók szerint hozzájárulnak az egerek akut O3 expozícióját kísérő neutrofil beáramláshoz (14, 29, 32, 33, 41, 45, 66, 71 ). Fontos, hogy hiperglikémia jelenlétében más akut gyulladásos ingerek is sok ilyen kemokin nagyobb indukcióját eredményezik (19).

A szisztémás gyulladás markerei.

A vérmintákat szívpunkcióval vettük ki, szérumot izoláltunk és -20 ° C-on tároltunk, amíg ELISA-val nem vizsgáltuk MCP-1, leptin és adiponectin (R&D Systems). Mivel az O3 expozíció önmagában megváltoztathatja ezeket a tényezőket, a vizsgálatokat csak a mechanikai vizsgálatokban használt egerek szérumán végeztük.

Statisztikai analízis.

A testsúly különbségei, RL, nyers, G, H, A BAL paramétereket és a gyulladás szérum markereit faktoriális ANOVA-val értékeltük, fő hatásként genotípust és gyógyszeres kezelést alkalmaztunk. Mindkét esetben a Fishers legkevésbé szignifikáns különbségtesztet alkalmaztuk post hoc összehasonlításokhoz. A szérum glükóz összehasonlítását nem párosított Student-ek végezték t-tesztek. A statisztikai elemzéseket SAS szoftverrel (SAS Institute, Cary, NC) végeztük. Minden eredmény átlag ± SE, ha másként nem jelezzük. P

Asztal 1. A pulmonális, légúti és parenchymás mechanika kiindulási mérése elhízott db/db és sovány, vad típusú, vízzel vagy metforminnal kezelt egerekben

Az értékek átlag ± SE. A méréseket 24 órával az utolsó szondázás után végeztük. RL, tüdőrezisztencia; Nyers, légúti ellenállás; G, a tüdőszövet csillapításának együtthatója; H, a tüdőszövet rugalmassági együtthatója.

* P zsír az egerek és az étrend által kiváltott elhízás egerek szintén a fokozott légúti és nem szöveti válaszok következményei (31, 32, 66).

ÁBRA. 1.A teljes pulmonalis rezisztencia (RL) változásai (A), légúti ellenállás (nyers)B) és a tüdőszövet csillapításának együtthatója (G) (C) intravénás metakolin indukálta vad típusú (WT) és db/db egerek. Az egereket szondával kezeltük vízzel vagy metforminnal naponta egyszer, 2 hétig. A méréseket 24 órával az utolsó kezelés után végeztük. Az eredmények az egyes csoportok 6–7 egérének adatainak átlagértékei ± SE. *P

A metformin egyikükben sem volt hatással a metakolin által kiváltott tüdőmechanikai változásokra db/db vagy vad típusú egerek. A faktoriális ANOVA a genotípus jelentős hatásait jelezte (P

ÁBRA. 2.Bronchoalveoláris átmosási neutrofilek (A), keratinocita eredetű kemokinek (KC) (B), makrofág gyulladásos fehérje 2 (MIP-2)C), LPS által indukált C-X-C kemokin (LIX)D), interferonnal indukálható fehérje 10 (IP-10)E) és monocita kemoattraktáns fehérje 1 (MCP-1)F) WT és db/db O3-nak kitett egerek (2 millió rész 3 órán át). Az egereket 4 órával az O3 expozíció leállítása után vizsgáltuk, és az expozíció előtt 2 hétig naponta vízzel vagy metforminnal kezeltük szondával. Az eredmények csoportonként 5-6 egér adatainak átlagértékei ± SE. *P

Megmértük az O3 által indukált és a neutrofilekre kemotaktikus aktivitással rendelkező kemokinek BAL-koncentrációit is (2. ábra). A hiperglikémia kimutatták, hogy sok ilyen kemokin indukcióját befolyásolja, amely más gyulladásos ingerekre válaszul fordul elő (19, 40). A faktoriális ANOVA a törzs jelentős hatását jelezte a BAL MIP-2, KC, MCP-1, LIX és IP-10 (P

ÁBRA. 3.Szérum MCP-1 (A), leptin (B) és az adiponektin (C) megvilágítatlan WT és db/db metforminnal vagy vízzel kezelt egerek minden héten 2 hétig. Az eredmények csoportonként 6–8 egér adatainak átlagértékei ± SE. *P

Adataink azt mutatják, hogy a metforminnal végzett napi 2 hét a kövér egerekben enyhíti a hiperglikémiát anélkül, hogy megváltoztatná sem veleszületett AHR-jüket, sem az O3-ra adott fokozott tüdőgyulladásos válaszukat. Az adatok azt mutatják, hogy ezen elhízott egerek pulmonális fenotípusa valószínűleg nincs összefüggésben hiperglikémiájukkal.

A hiperglikémia potenciális szerepének felméréséhez kezeltük db/db egerek antihiperglikémiás szerrel, metforminnal. A metformin az éhomi vércukorszint jelentős csökkenését okozta, hasonló módon kezelt elhízott egereken végzett korábbi vizsgálatokkal összhangban (17, 18, 70). A metformin csökkentette a szérum glükózszintjét a nem gyors állapotban db/db egerek, bár a glükóz jóval a vad típusú értékek felett maradt. A metformin azon képessége, hogy csökkenti a vércukorszintet, abból adódik, hogy növeli a vázizomzat glükózfelvételét (47) és csökkenti a máj glükoneogenezisét (69). Úgy tűnik, hogy ezeket a hatásokat az inzulinérzékenység (7) változásai közvetítik, amelyeket az AMP-aktivált protein-kináz (AMPK), az energiaállapotú sejtérzékelő aktiválása vált ki (76.

A korábbi jelentésekkel (41) összhangban az elhízottaknál nagyobb légúti reakciót figyeltünk meg az intravénás metakolinra db/db a sovány vad típusú egerekhez képest (1. ábra). Bár a metformin ezekben az egerekben lényegesen csökkentette az éhomi hiperglikémiát, ez nem változtatta meg velük született AHR-jüket (1. ábra). Az eredmények arra utalnak, hogy ezen elhízott egerek fenotípusának a hiperglikémián kívüli aspektusai jelentik az AHR-jüket, bár elképzelhető, hogy még a vércukorszint mérsékelt növekedése is, mint az éheztetésben maradt, db/db a metforminnal kezelt egerek hozzájárulhatnak az AHR-hez.

Összefoglalva elmondhatjuk, hogy adataink azt mutatják 1) veleszületett AHR és 2) elhízott egerekben fokozott O3-indukálta neutrofil beáramlás és kemokin expresszió figyelhető meg. Ezeket az elhízással kapcsolatos különbségeket a metformin-kezelés nem csillapította, annak ellenére, hogy csökkent az éhomi vércukorszint, ami arra utal, hogy a hiperglikémia valószínűleg nem veszi figyelembe ezen elhízott egerek tüdőfenotípusát.

Ezt a tanulmányt az Országos Környezet-egészségügyi Tudományok Intézetének ES-013307 és ES-00002 támogatásai, az Országos Szív-, Tüdő- és Vérkutató Intézet HL-084044 és HL-33009 támogatásai, valamint Paul és Mary Finnegan nagylelkű ajándéka támogatta.