A szivárványos pisztráng (Oncorhynchus mykiss) glükóz metabolizmusának ontogenezise a közelmúltban

ABSZTRAKT

BEVEZETÉS

Jelen tanulmány célja a glükóz metabolizmus gének elemzése volt, azaz a két fő glükózzal kapcsolatos útvonalhoz: glikolízishez és glükoneogenezishez tartozó gének (S1. ábra), hogy: (i) azonosítsák és jellemezzék a szivárványos pisztrángban a duplikált glikolízis gének evolúcióját (azaz a máj foszfofruktokinázát és a máj piruvát kinázt); (ii) meghatározza a duplikált glükóz-anyagcserével kapcsolatos gének expressziós mintázatát, azaz glikolitikus gének (glükokináz-paralógok, gcka és gckb; máj-foszfofruktokináz-paralógok, pfkla és pfklb; máj- és vörösvértest-piruvát-kináz, pklr) és glükoneogén gének (citoszolikus és mitokondriális foszfoenol-piruvát-karboxi-kinázok: pck1-p21, illetve p21; és fbp1b2; glükóz-6-foszfatáz-paralógok g6pca, g6pcb1.a, g6pcb1.b, g6pcb2.a és g6pcb2.b), valamint ezek megfelelő általános enzimaktivitása a máj ontogenezisének kritikus fejlődési szakaszában; és (iii) tanulmányozza ezen gének expressziós mintázatát az endogén és az exogén táplálkozás közötti táplálkozási átmenet során nem vagy magas szénhidráttartalmú étrenddel táplált pisztrángban.

metabolizmusának

ANYAGOK ÉS METÓDUSOK

Etikai nyilatkozat

A kísérletet a tudományos célokra felhasznált állatok védelmével kapcsolatos uniós jogi keretek (2010/63/EU irányelv) és az állatok etikai bánásmódját szabályozó francia jogszabályok irányelveinek (2001-464. 2001. május 29.). Állatkísérletek elvégzésére a Direction Departementale des Services Veterinaires (francia állatorvosi szolgálat) hagyta jóvá (INRA 2002–36, 2002. április 14.). Az INRA kísérleti állomás állatkísérleti tanúsítvánnyal rendelkezik. A francia állatorvosi szolgálat, az illetékes hatóság által az A64.495.1.

Hal diéták

Két kísérleti takarmány a szivárványos pisztráng alevinek, azaz no-CHO-t (szénhidrát nélküli étrend) és magas-CHO-t (nagyon magas szénhidráttartalmú étrend) saját létesítményeinkben (INRA, Donzacq, Landes, Franciaország) készítettünk extrudált pelleteként. Szénhidrátforrásként glükózt és zselatinizált keményítőt tartalmaztak; a fehérje a hallisztből, az étrendi lipidek pedig a halolajból és a hallisztből származnak (1. táblázat). A két étrendben hasonló mennyiségű lipid volt. A magas szénhidráttartalmú étrendben az étrendi szénhidráttartalom nagy növekedését (~ 60%) a fehérje kisebb hányada (~ 20%) kompenzálta. A nem-CHO étrendhez nem adtak szénhidrátot, amely ~ 60% nyersfehérjét tartalmazott.

A két kísérleti étrend (nem-CHO és magas-CHO) összetétele és közeli összetétele

Hal és kísérleti tervezés

A diéták elemzése

A diéták kémiai összetételét a következő eljárásokkal elemeztük: a szárazanyagot 24 órán át 105 ° C-on végzett szárítás után elemeztük, lipidtartalmat petroléter-extrakcióval (Soxtherm), fehérjetartalmat (N × 6,25) a Kjeldahl-módszer savas emésztés után a bruttó energiát adiabatikus bombakaloriméterben (IKA, Heitersheim Gribheimer, Németország) mértük, a hamutartalmat pedig úgy, hogy a mintákat muffuskemencében 6 órán át 600 ° C-on elégettük.

Oociták, embriók és endogén tápláló alevinek testösszetételének elemzése

A glikogén- és glükóz-tartalmat 600 mg összegyűjtött halban (petesejtek, embriók a 2. és 23. szakasz között, valamint endogén tápláló alevinek, 31. szakasz) elemeztük. A glikogén-tartalmat hidrolízis technikával határoztuk meg, amelyet Good és mtsai. (1933). Mindegyik mintát 1 mol l-1 HCl-ben (VWR, USA) őröltük. Ebben a szakaszban alikvotot mentettünk a szabad glükóz tartalom mérésére. 10 perces centrifugálás után 10 000-nél g, a szabad glükózszintet az Amplite ™ fluorimetrikus glükóz mennyiségi meghatározó készlet (AAT Bioquest ®, Inc., USA, USA) segítségével mértük a gyártó utasításainak megfelelően. A megmaradt őrölt szövetet 100 ° C-on 2,5 órán át forraljuk, majd 5 mol/1 KOH-dal semlegesítjük (VWR, USA). Az oldat pH-ját ezután 7,4-re állítottuk, és az összes glükózt (szabad glükóz + glikogén-hidrolízissel nyert glükóz) megmértük ugyanazon kit alkalmazásával, mint korábban. A glikogén-tartalmat a szabad glükózszint levonásával értékeltük.

Az összes lipidtartalmat két példányban határoztuk meg Barnes és Blackstock (1973) által leírt szulfofoszfovanilun módszerrel, koleszterin helyett halolaj-standardot (Sopropeche, Boulogne-sur-Mer, Franciaország) alkalmazva.

Az összes fehérjetartalmat szintén kétszer mértük a Kjeldahl-módszer alkalmazásával, mint az étrendi elemzéshez.

In silico elemzés

A szivárványos pisztráng genomjában található ortológ pfkl és pklr géneket (Berthelot et al., 2014) a SIGENAE adatbázisból kivont Oncorhynchus mykiss genom böngészőben (Genoscope: http://www.genoscope.cns.fr/trout/) azonosítottuk ( http://www.sigenae.org) a BLAST eszközzel (az összes csatlakozási számot a 2. táblázat tartalmazza). Más fajok szekvenciáit az Ensembl Genome adatbázisból gyűjtöttük össze (Ensembl 77. kiadás, 2014. október: http://www.ensembl.org). Az EMBL Pfam szoftver (http://pfam.xfam.org) szekvenciaelemző eszközét használtuk a szekvenciaazonosságok megerősítésére. Genomicus szoftvert, v01.01 (http://www.genomicus.biologie.ens.fr/genomicus-trout-01.01/cgi-bin/search.pl) használtunk a pfkl gének azonosságának megerősítésére.

Példa szekvenciák és hozzáférési számok a qPCR elemzéshez

A pklr filogenetikai elemzését (1. ábra) a MEGA package v6 szoftver (Tamura et al., 2013) alkalmazásával hajtottuk végre, amint azt korábban leírtuk (Marandel et al., 2015). A levezetett teljes hosszúságú aminosav-szekvenciák alapján a filogenetikai fát a szomszédos csatlakozási (NJ) módszerrel állítottuk elő, és a minimális evolúciós módszerrel igazoltuk (az adatokat nem mutatjuk be). A következtetett fák megbízhatóságát a bootstrap módszerrel becsültük, 1000 replikációval. A fa gyökerezéséhez a Petromyzon marinus pk (Ensembl Accession ENSPMAP00000000233) fehérjeszekvenciát használtuk. Az evolúciós távolságokat Poisson-korrekciós módszerrel (Zuckerkandl, 1965) számoltuk ki, és helyenként aminosav-szubsztitúciók számának egységében fejeztük ki. Az elemzés 10 aminosavszekvenciát tartalmazott. Minden hiányosságot és hiányzó adatot tartalmazó pozíciót megszüntettünk, így a végső adatkészletben összesen 127 pozíció maradt.

A Pklr (máj- és vörösvértest-piruvát-kináz) filogenetikai elemzése. A levezetett aminosav szekvenciákat MUSCLE szoftverrel igazítottuk (Edgar, 2004). A filogenetikai elemzést a Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA) szoftver v6.0 alkalmazásával végeztük (Tamura és mtsai, 2013). A filogenetikai fát a szomszéd-összekötő (NJ) módszerrel építettük. A következtetett fa megbízhatóságát a bootstrap módszerrel becsültük meg, 1000 replikációval. A fa gyökerezéséhez a mályva pklr szekvenciát (Petromyzon marinus, Ensembl ID: ENSPMAP00000000233) használtuk. A fehérje belépési számok zárójelben vannak feltüntetve.

Új gén annotációk kerültek kiosztásra a ZFIN Nómenklatúra irányelvei szerint (http://zfin.org/). Az összes szekvenciát és a levezetett részleges aminosavakat az 1. és 2. ábra szemlélteti. S2.

Teljes RNS extrakció és cDNS szintézis

A relatív génexpressziót kvantitatív valós idejű RT-PCR-rel határoztuk meg. A mintákat Precellys® 24 (Bertin Technologies, Montigny-le-Bretonneux, Franciaország) alkalmazásával homogenizáltuk: (1) 7 ml-es csövekben, amelyek Trizol reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) és 2,8 mm-es kerámia gyöngyöket tartalmaztak 2 × 30 másodpercig, 15 másodperccel elválasztva, oociták és embriók esetében 5500 fordulat/perc sebességgel (mintánként és ívásnál 30); és (2) 2 ml-es csövekben, amelyek Trizol reagens (Invitrogen) és 2,8 mm-es kerámia gyöngyöket tartalmaznak 2 × 20 másodpercig, 15 másodperccel elválasztva, 5500 fordulat/perc sebességgel alevinek esetében (1 alevin csövenként, 6 alevin ívásonként/diéta kevert és exogén tápláló halak). Luciferáz kontroll RNS-t (Promega), 10 pg/1,9 mg embrió/alevin vagy petesejtet adtunk minden mintához, hogy lehetővé tegyük az adatok normalizálódását a korai fejlesztés során, a korábban leírtak szerint (Desvignes et al., 2011; Marandel et al., 2012) . Ezután a teljes RNS-t a gyártó utasításainak megfelelően extraháltuk. A teljes RNS-t (1 μg) használtuk a cDNS szintéziséhez. A Super-Script III RNSse H-Reverse transzkriptáz készletet (Invitrogen) véletlenszerű primerekkel (Promega, Charbonniéres, Franciaország) alkalmaztuk a cDNS szintetizálásához.

Valós idejű RT-PCR

Általános enzimaktivitás

Statisztikai analízis

Az eloszlások normalitását Shapiro - Wilk teszttel értékeltük. Ezután az adatokat Kruskal-Wallis nem-parametrikus teszttel, majd post-hoc elemzésként Tukey-próbával elemeztük. Az adatokat az R szoftver (v3.1.0)/R Commander csomag segítségével elemeztük.

EREDMÉNYEK

A szivárványos pisztráng pfkl és pklr gének in silico elemzése

Nem találtunk pklr ortológ gént a szivárványos pisztráng genomjában (akár Genomicus szoftver segítségével, akár közvetlen BLAST segítségével a szivárványos pisztráng genomjával szemben), de magas szekvenciájú (kb. 75%) EST-kontig (Sigenae, AF246146.s.om.10) teleost pklr génekkel azonosították. Filogenetikai analízist hajtottak végre azonosságának igazolására, és ez azt mutatta, hogy a folytonos gerinces pklr ortológokkal csoportosult (1. ábra). Ezenkívül a Pfam-elemzés megerősítette, hogy a pisztrángszekvencia egy piruvát-kinázt kódoló génhez kapcsolódik. Összegzésként elmondhatjuk, hogy in silico elemzésünk két párhuzamos pfkl gént azonosított a szivárványos pisztráng genomjában, az egyik ortológ a zebrafish pfkla (állvány 7584), a másik a zebrafish pfklb (állvány 8651, GSONMG00001975001) és egy pklr ortológ gén (Sig AF246146.s.om.10).

A glükóz metabolizmussal kapcsolatos géntermékek expressziójának elemzése és általános enzimatikus aktivitása az embrió fejlődése során

Valós idejű PCR-t végeztünk a szivárványos pisztráng glükóz metabolizmusával kapcsolatos gének szakaszspecifikus expressziójának meghatározására embriogenezis során és kikelt alevinekben. A szakaszokat a Vernier-fejlesztési táblázat (Vernier, 1969) alapján határozták meg, és úgy döntöttek, hogy a glükóz-anyagcsere vizsgálat szempontjából érdekes fejlődési periódusokat célozzák meg [azaz petesejt a 8. szakaszig, az embrionális genom aktiválása (EGA) előtt; 10. szakasz, EGA; 12. és 15. szakasz, epiboli periódus; 22. szakasz, primitív máj; 23. szakasz, primitív májkapu véna és 31. szakasz, kikelt embrió/endogén táplálkozási periódus]. Ez az elemzés kimutatta (2. ábra), hogy az összes glükóz-metabolikus gén mRNS-szintje az EGA (10. szakasz) után növekedett, hogy elérje a maximális szintet a 22. és 23. szakaszban, kivéve a g6pcb1.b és g6pcb2.b, amelyek mRNS-szintje emelkedett a 31. szakaszig.

A glükoneogén és glikolitikus gének expressziós mintázata a fejlődés során. Az adatok a glükoneogén (bal) és a glikolitikus (jobb) gének relatív bősége a fejlődés során. Az embriókból Vernier (1969) szerint vettünk mintát az O (oocita), a 2., 5., 6., 7., 8., 10., 12., 15., 22. és 23., valamint a 31. (alevin) szakaszban. Minden szakaszban a génexpresszió szintjét normalizálták az exogén luciferáz RNS bőségével. Az adatokat átlagként ± s.e.m. (N = 3 embrióállomány, ívásonként egy 30 embriót tartalmazó készlet). A különböző betűk jelentős eltéréseket jeleznek a feltételek között (P Tekintse meg ezt a táblázatot:

  • Soron belüli megtekintése
  • Felugró ablak megtekintése
  • Powerpoint letöltése

Általános enzimaktivitás

A testösszetétel az embrió fejlődése során

Az embrióban előforduló makrotápanyagok relatív fogyasztásának és a tojássárgája tartalékának követése érdekében a fejlődés során a fehérje, a lipid és a szénhidrát (azaz a glükóz és a glikogén) szintjét mértük. A fejlesztés során nem tapasztaltak statisztikailag szignifikáns eltérést a lipid- vagy fehérjeszintben (4. táblázat). Bár az embriók teljes szénhidráttartalma (4. táblázat, 3. ábra) a fejlődés során nem változott szignifikánsan, úgy tűnt, hogy a 22. és 23. szakaszban csökken, csakúgy, mint a glikogén tartalom (3. ábra).

Az embriók és a kikelt alevinek testösszetétele