A veleszületett lipodystrophia súlyos osteosclerosist vált ki

Szerepek Konceptualizálás, Adatkúra, Formális elemzés, Írás - eredeti vázlat

súlyos

Anatómiai és molekuláris patológia hovatartozási osztálya, Washington Egyetem Orvostudományi Kar Patológiai és Immunológiai Tanszéke, St. Louis, MO, Amerikai Egyesült Államok

Szerepek konceptualizálás, adatgondozás

Anatómiai és molekuláris patológia hovatartozási osztálya, Washington Egyetem Orvostudományi Kar Patológiai és Immunológiai Tanszéke, St. Louis, MO, Amerikai Egyesült Államok

Szerepek Adatmegőrzés, vizsgálat, validálás

A Washington Egyetem Orvostudományi Karának Patológiai és Immunológiai Tanszékének laboratóriumi és genomikai orvostudományi tagozata, St. Louis, MO, Amerikai Egyesült Államok

Szerepek Az adatok kezelése

A Washington Egyetem Orvostudományi Karának Patológiai és Immunológiai Tanszékének Anatómiai és Molekuláris Kórtani Tagsági Osztálya, St. Louis, MO, Amerikai Egyesült Államok, Translational Medicine Center, Xi'an Jiaotong University első társult kórháza, Xi'an, Shanxi, Kínai Népköztársaság

Szerepek konceptualizálás, adatgondozás

Csont- és ásványi betegségek hovatartozási osztálya, Orvostudományi Osztály, Washington Egyetem Orvostudományi Kar, St. Louis, MO, Amerikai Egyesült Államok

Szerepek konceptualizálás, adatgondozás

Csont- és ásványi betegségek hovatartozási osztálya, Orvostudományi Osztály, Washington Egyetem Orvostudományi Kar, St. Louis, MO, Amerikai Egyesült Államok

Szerepek Az adatok kezelése

Washington Egyetem Orvostudományi Karának Ortopédiai Sebészeti Osztálya, St. Louis, MO, Amerikai Egyesült Államok

Szerepek Az adatok kezelése

Washington Egyetem Orvostudományi Karának Ortopédiai Sebészeti Osztálya, St. Louis, MO, Amerikai Egyesült Államok

Szerepek Konceptualizálás, írás - áttekintés és szerkesztés

Washington Egyetem Orvostudományi Karának Ortopédiai Sebészeti Osztálya, St. Louis, MO, Amerikai Egyesült Államok

Szerepek konceptualizálás, formális elemzés, vizualizáció

Endokrinológiai, anyagcsere- és lipidkutatási tagsági osztály, Washington Egyetem Orvostudományi Karának Orvostan Tanszék, St. Louis, MO, Amerikai Egyesült Államok

Szerepek konceptualizálás, finanszírozás megszerzése, felügyelet, írás - áttekintés és szerkesztés

A Washington Egyetem Orvostudományi Karának Patológiai és Immunológiai Tanszékének Anatómiai és Molekuláris Kórtani Tagsági Osztálya, St. Louis, MO, Amerikai Egyesült Államok, Csont- és ásványi betegségek osztálya, Orvostudományi Kar, Washington Egyetem Orvostudományi Kar, St. Louis. Louis, MO, Amerikai Egyesült Államok

  • Wei Zou,
  • Nidhi Rohatgi,
  • Jonathan R. Brestoff,
  • Yan Zhang,
  • Erica L. Scheller,
  • Clarissa S. Craft,
  • Michael D. Brodt,
  • Nicole Migotsky,
  • Matthew J. Silva,
  • Charles A. Harris

Ábrák

Absztrakt

A Berardinelli-Seip veleszületett generalizált lipodystrophiája a megnövekedett csonttömeggel jár, ami arra utal, hogy a zsírszövet szabályozza a csontvázat. Mivel kevés mechanisztikus információ van erről a kérdésről, "zsírmentes" (FF) egereket állítottunk elő, amelyekből hiányzott a látható zsigeri, szubkután és barna zsír. A robusztus oszteoblaszt aktivitás miatt ezekben az állatokban a trabecularis és a korticalis csontmennyiség jelentősen megnő. Az FF egerek, mint a Berardinelli-Seip betegek, cukorbetegek, de normalizálják a glükóz toleranciát és jelentősen csökkentik a keringő inzulint, és nem változtatják meg a csontváz fenotípusukat. Fontos, hogy az FF egerek csontváz fenotípusát teljesen megmentik adipocita prekurzorok vagy fehér vagy barna zsírraktárak átültetése, ami azt jelzi, hogy az adipocita eredetű termékek szabályozzák a csonttömeget. Megerősítve ezt, az adiponektinből és a leptinből származó kettős knockout egerekből származó zsír transzplantációja, ellentétben a WT-társaikkal kapottakkal, nem normalizálja az FF-csontot. Ezek a megfigyelések arra utalnak, hogy a leptin és az adiponektin kevés hozzájárulhat a Berardinelli-Seip betegek megnövekedett csonttömegéhez.

Szerző összefoglalása

A Berardinelli-Seip veleszületett generalizált lipodystrophiája a megnövekedett csonttömeggel járó emberi rendellenesség, ami arra utal, hogy a zsír önmagában szabályozza a csontvázat. Ennek a hipotézisnek a teszteléséhez létrehoztuk a veleszületett generalizált lipodystrophia egér modelljét, amelyben a barna és a fehér zsírszövet is teljesen kimerült az embriogenezis során. Ezek a „zsírmentes” (FF) az egész testben jelentősen megnövelik a csonttömeget. A megnövekedett csonttömeg a csontképződés stimulálását jelenti, és nem késlelteti a csont lebontását. Ezenkívül az FF egerek megnövekedett csonttömege jelentősen növeli a csontváz szilárdságát és a töréssel szembeni ellenállást. A veleszületett lipodystrophiában szenvedő betegekhez hasonlóan az FF egerek is cukorbetegek, de metabolikus állapotuk nem járul hozzá megnövekedett csonttömegükhöz. A csonttömeget szabályozó zsírtermelő molekulák azonosításához genetikailag módosított zsírszövetet ültettünk át FF egerekbe, amelyek megállapították, hogy a zsírtermelő molekulák, az adiponektin és a leptin hiánya jelentősen fokozza a csontképződést. Ezek a megfigyelések azt sugallják, hogy az adiponektin és a leptin csontra gyakorolt ​​együttes hatásának csökkentése növeli annak bőségét és törésállóságát.

Idézet: Zou W, Rohatgi N, Brestoff JR, Zhang Y, Scheller EL, Craft CS és mtsai. (2019) A veleszületett lipodystrophia súlyos osteosclerosist indukál. PLoS Genet 15 (6): e1008244. https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1008244

Szerkesztő: Baron Roland, szóbeli orvostudomány, fertőzés és immunitás Harvard Fogorvosi Iskola, AMERIKAI EGYESÜLT ÁLLAMOK

Fogadott: 2019. január 2 .; Elfogadott: 2019. június 12 .; Közzétett: 2019. június 24

Adatok elérhetősége: Minden lényeges adat a kéziratban és a támogató információs fájlokban található.

Finanszírozás: Ezt a munkát a Children's Discovery Institute MI-F-2019-795 (JRB) pályázata támogatta; Országos Egészségügyi Intézet az R37 AR046523 (SLT), R01 DK111389 (SLT), P30 AR057235 (SLT, CSC és MJS), R00 DE024176 (ELS), R01 AR047867 (MJS) és R01 DK106083 (CAH) támogatásokat nyújtja. A finanszírozóknak nem volt szerepük a tanulmányok tervezésében, adatgyűjtésben és elemzésben, a közzétételre vonatkozó döntésben vagy a kézirat elkészítésében.

Versenyző érdeklődési körök: A szerzők kijelentették, hogy nincsenek versengő érdekek.

Bevezetés

Az elmúlt évtizedek elegáns tanulmányokat tettek az energia-anyagcsere és a csont kapcsolatáról, és arra a következtetésre jutottak, hogy kölcsönösen szabályozóak. E forgatókönyv szerint a kiválasztott adipokinek az oszteoblasztok és az oszteoklasztok közvetlen és közvetett célzásával befolyásolják a csontváz tömegét [1–4]. Ezek a tanulmányok, amelyek közül sok ellentmondó adatot szolgáltat, jellemzően farmakológiailag vagy genetikailag módosítják az adipokin-bőséget. Az a felismerés, hogy a fehér zsírszövet különböző depóitáinak (WAT) eltérő élettani hatása van, betekintést engedett ebbe az enigmába [5–7]. Míg a szubkután zsír, amely főleg a combokban és a fenékben található, korrelál a megnövekedett csonttömeggel, a metabolikus szindrómára jellemző megnövekedett zsigeri zsír osteoporosishoz kapcsolódik [1–3, 6]. Hogy miért fordul elő ez a megkülönböztetés, azonban teljesen ismeretlen, és nincs mechanikus bizonyíték arra, hogy a zsír és a csont rengetegsége közötti ok/okozati összefüggés áll fenn.

Eredmények

FF egerek generálása

Amint azt leírtuk [9], az FF egerek generálása magában foglalta a diftéria toxin (DTA) transzgént hordozó keresztezését egy lebegtetett stop kodontól (DT-STOP fl/fl) lefelé az adiponektin Cre (+/-) expressziós egerek felé. A babatársak kontrollként szolgálnak. Az adiponektin Cre egyedi expressziójának megfelelően az adipocitákban és azok prekurzoraiban a párosodás összes Cre + terméke nem tartalmaz észlelhető WAT-ot, amelyet gyakorlatilag nem detektálható keringő adiponektin vagy leptin, valamint visfatin és rezisztin igazol [10] (1. ábra). A BAT szintén hiányzik, és ennek következtében az FF egerek hideg-intoleránsak, mivel az elválasztás előtt túlélésükhöz 30 ° C-on kell tartani. Váratlanul az FF egerekben a velő adipociták száma nem változik. Az FF egerek testtömege az életkor előrehaladtával fokozatosan csökken, a WT-hez viszonyítva, de a különbség csak 20 héten belül éri el a statisztikai szignifikanciát. A növekedés nem változik, ezt bizonyítja a combcsont hossza, és az FF egereknél jelentős a splenomegalia (S1 ábra).

A kontroll és FF egerek szérum adipokinjai. Az adatokat átlag ± SD-ként adjuk meg. *** p 2. ábra: A veleszületett zsírhiány elősegíti az oszteoszklerózist.

A) 3 hónapos kontroll és FF egerek combcsontjainak röntgenfelvétele. B) Az FF és a kontroll alomtársak combcsontjainak életkorfüggő μCT képei. C) Kvantitatív μCT elemzés B. D) Három hónapos FF és kontroll sípcsont trabecularis csontmennyiségének hisztomorfometrikus elemzése. E) 3 hónapos kontroll és FF alomtársak csigolyáinak (L3-5) μCT képei. F) A trabecularis csonttérfogat és a csont ásványi sűrűségének kvantitatív μCT elemzése. Az adatokat átlag ± SD-ként adjuk meg. * p 3. ábra: A veleszületett zsírhiány elősegíti a csontképződést.

A) FF és kontroll egerek szérum osteokalcinja. B) A 6 hetes FF és kontroll egerek combcsontjaiból kivont RNS-ben lévő oszteoblaszt differenciálódási markerek qPCR elemzése. C) A kontroll disztális combcsontjának fluoreszcens mikroszkópos képei és az FF egereknek időközönként beadott kalceint adtunk be. Méretarány: 400 μm. D) A teljes csontképződési sebesség (BFR), a trabecularis felület mm-re eső csontképződési sebessége (BFR/BS) és a trabecularis csont ásványi tapadási sebességének (MAR) hisztomorfometriás elemzése. E) TRAP-festett (vörös reakciótermék) kontroll és FF combcsont. Az FF endokortikális felületet oszlopos oszteoblasztok (nyilak) szegélyezik, amelyek jellemzőek a robusztus csontképződésre. Méretarány: 800 μm. F) Az endokortikális MAR hisztomorfometriai elemzése. D) A periosztealis MAR hisztomorfometriai elemzése. Az adatokat átlag ± SD-ként adjuk meg. * p 4. ábra: A zsír veleszületett hiánya növeli az oszteoklasztok számát, de nem működik.

A) FF és kontroll egerek TRAP5b széruma. B) Az oszteoklasztszám/mm csontfelület hisztomorfometriai elemzése. C) 6 hetes FF és kontroll egerek combcsontjaiból kivont RNS-ben lévő oszteoklaszt differenciálódási markerek qPCR elemzése. D) TRAP festett FF és kontroll csontok. Méretarány: 100 μm. E) A szérum CTx aránya az FF és a kontroll egerek TRAP5b-jéhez. Az adatokat átlag ± SD-ként adjuk meg. * p 5. ábra: A veleszületett zsírhiány növeli a csontok szilárdságát.

Az FF és a kontroll femorális (A) merevség és (B) végső erő (az egész csont erejének mértéke) hajlítási tesztek. (C) A diaphysealis csontterület μCT elemzése. (D) Poláris tehetetlenségi nyomaték. (E) A hozam utáni elmozdulás. (F) Törésig tartó munka. Az adatokat átlag ± SD-ként adjuk meg. * p 6. ábra. Az FF egerek oszteoszklerózisát nem a metabolikus szindróma okozza.

A) Balra: Zsírtömeg (nyíl) FF egérben 4 hónappal a szubkután MEF transzplantáció után. Jobbra: A WT MEF transzplantáció normalizálja az FF máj (csillag) májméretét. B) A zsír tömegének szövettani képe FF egérben 4 hónappal a szubkután MEF transzplantáció után; Méretrúd: 1mm. C) Az FF máj szövettani képei, amelyek súlyos steatózist mutatnak (bal oldali panel) színlelt műtétű egerekben és MEF transzplantációval történő eliminációja (jobb oldali panel). Méretarány: 400μm. D) μCT képek és E) kvantitatív elemzés az FF egerek distalis combcsontjainak trabekuláris térfogata és csontásványsűrűsége 4 hónappal a színlelt műtét vagy a MEF transzplantáció után. F) A tibialis trabecularis csontmennyiség és az oszteoklaszt-szám hisztomorfometrikus vizsgálata WT kontrollokban és FF egerekben 4 hónappal a színlelt műtét vagy a MEF transzplantáció után. G) FF egerek combcsontjainak röntgenfelvétele 3 hónappal az álműtét vagy a különféle zsírraktárak átültetése után. H) Az FF egerek disztális combcsontjainak trabekuláris csontmennyiségének és csontásványsűrűségének μCT-analízise 3 hónappal a színlelt műtét vagy a különféle zsírraktárak átültetése után. Az adatokat átlag ± SD-ként adjuk meg. * p 8. ábra. A leptin és az adiponektin hiánya mérsékli az FF osteosclerosisát.

A) Transzplantált zsírraktárak a műtét után 3 hónappal. B) A zsírraktár súlya 3 hónappal a transzplantáció után. C) FF egerek szérum leptinje és adiponektinje 3 hónappal a zsírraktár transzplantáció után. WT és nem transzplantált FF egerek szolgálnak kontrollként. D) Az FF egerek distalis combcsontjainak trabekuláris csontmennyiségének és csontásványsűrűségének μCT-analízise 3 hónappal az álműtét vagy a WT vagy adipokinhiányos egerekből származó zsír transzplantációja után. Az adatokat átlag ± SD-ként adjuk meg. ** p-, TER-119-, CD41-, CD11b-, LepR + sejtek.

GTT és ITT

Glükóz-tolerancia teszteket (GTT) 2 hónapos hím egereken végeztek tiszta ketrecekben, éhezésnek vetették alá, 6 órán keresztül szabad vízhez jutással. Az egereket lemértük, és a farokvénából kis mennyiségű vért nyertünk a kiindulási (0. idő) glükózméréshez. Az egereket ezután intraperitoneálisan 50% steril dextrózzal (1 mg/g testtömeg) injektáltuk. A farok vércukorszintjét 15, 30, 60, 90 és 120 perccel határoztuk meg a fertőzés után Bayer Contour glükométerrel. Az inzulin tolerancia teszthez (ITT) 2 hónapos hím egereket helyeztek tiszta ketrecekbe, élelem és szabad vízhez való hozzáférés nélkül. 6 órás böjt után az egereket lemértük, és a Bayer Contour glükométerrel megmértük az alapértékeket. Az egereknek intraperitoneálisan humán inzulint (Humulin, Eli-Lilly) injektáltak 0,7 E/kg testtömeg és vércukorszint dózisban, az inzulininjekció után 15, 30, 45, 60, 90, 120 perccel mérve.

Szövettan és hisztomorfometria

A combcsontot és a sípcsontot 10% semleges pufferolt formalinban rögzítettük, majd dekalkifikálást végeztünk 14% EDTA-ban 10 napig, paraffinbeágyazással és TRAP festéssel. A statikus és dinamikus hisztomorfometriai paramétereket a BioQuant OsteoII (BioQuant Image Analysis Corporation, Nashville, TN) alkalmazásával vak módon mértük.

Calcein címkézés

Két hónapos hím FF és kontroll alomtársakat intraperitoneálisan injektáltunk kalceinnel (Sigma) (7,5 mg/testtömeg-kg) a 6. és 2. napon az áldozat előtt. A combcsont dekalcifikálatlan szövettani szakaszait a BioQuant OsteoII (BioQuant Image Analysis Corporation, Nashville, TN) alkalmazásával elemeztük.

Mikrokomputertomográfia (μCT)

A trabekuláris csontot μCT40 szkennerrel (Scanco Medical AG, Bassersdorf, Svájc; 55 kVp, 145 μA, 300 ms integrációs idő, 16 μm voxel méret) szkenneltük. Alacsonyabb, 250-es küszöböt alkalmaztunk az összes vizsgálat értékeléséhez. Az érdekes trabekuláris csontrégió 100 szeletből állt, amelyeket az első szelettel kezdve húztak, amelyben a kondíliák és az elsődleges szivacsok már nem voltak láthatók, 1,6 mm hosszúak. A kortikális elemzések érdeklődési területe 50 szeletből állt, amelyek 0,8 mm hosszúságúak voltak a combcsont középtengelyén.

Zsírátültetés

Elsődleges egér embrionális fibroblasztokat (MEF) készítettünk WT C57/BL6 E14 embriókból, a leírtak szerint [9, 45]. A MEF-eket szubkután injektáltuk a két hónapos FF egerek szegycsontjába, amint arról beszámoltunk [9, 46]. Az egereket 4 hónappal a transzplantáció után feláldoztuk.

Az érett zsírraktárakat a leírtak szerint ültettük át [47], kis módosítással. A 2 hónapos FF egereket izofluránnal altattuk. A 6–8 hetes WT vagy adipokinhiányos egerekből származó donor zsírpárnákat steril PBS-be helyeztük, és 100–150 mg-os darabokra vágtuk. Az oltványokat szubkután beültetjük kis bemetszéseken keresztül a hát borotvált bőrébe, metszésenként 1 darabot. Minden darab FF egerbe 6 darab zsírgraftot ültettek be. A műtét után az egereket egy hétig külön-külön tartották, majd ketrecenként 5 egeret. Az egereket a transzplantáció után 3 hónappal leöltük.

Biomechanika

A combcsontokat (n = 5 csoportonként) a középtengelyen lévő microCT vizsgálta (Scanco uCT40; 70 kVp, 114 mA, 300 ms integrációs idő, 10 um vokselméret, 100 szelet) a keresztmetszeti geometriai tulajdonságok meghatározása céljából. Ezután mechanikusan tesztelték őket hárompontos függőben (Instron 8841; támaszfesztávolság: 7 mm; elmozdulási sebesség: 0,1 mm/sec). A hiba közvetlenül a töltési pont alatt, a combcsont 50% -ánál következett be. Az erő-elmozdulás adatait összegyűjtötték és elemezték a teljes csont (szerkezeti) mechanikai tulajdonságainak (merevség, végső erő, hozam utáni elmozdulás, munka és törés közötti) meghatározásához [14].

Statisztika