A vestibularis rendszer szerepe az elhízásban és a glükóz metabolizmusának károsodásában a magas zsírtartalmú étrenddel táplált egerekben

Naoyuki Kawao

1 Fiziológiai és Regeneratív Orvostudományi Tanszék, Kindai Egyetem Orvostudományi Kar, Osakasayama, Japán

Yoshimasa Takafuji

1 Kindai Egyetem Orvostudományi Kar Élettani és Regeneratív Orvostudományi Tanszék, Osakasayama, Japán

Masayoshi Ishida

1 Fiziológiai és Regeneratív Orvostudományi Tanszék, Kindai Egyetem Orvostudományi Kar, Osakasayama, Japán

Katsumi Okumoto

2 Élettudományi Kutatóintézet, Kindai Egyetem, Osakasayama, Japán

Hironobu Morita

3 Élettani Tanszék, Gifu Egyetem Orvostudományi Kar, Gifu, Japán

Masafumi Muratani

4 Genombiológiai Tanszék, Orvostudományi Kar, Tsukubai Egyetem, Tsukuba, Japán

Hiroshi Kaji

1 Fiziológiai és Regeneratív Orvostudományi Tanszék, Kindai Egyetem Orvostudományi Kar, Osakasayama, Japán

Társított adatok

Minden releváns adat megtalálható a dokumentumban és a kiegészítő információkat tartalmazó fájlokban.

Absztrakt

A vestibularis rendszer szabályozza az egyensúlyt, a testtartást, a vérnyomást és a gézt. A vestibularis rendszer energia- és glükóz-anyagcserében betöltött szerepe azonban továbbra sem ismert. Megvizsgáltuk a vestibularis rendszer szerepét az elhízásban és a csökkent glükóz-anyagcserében, a magas szacharóz/zsírtartalmú étrendet (HSHFD) tápláló vestibularis elváltozásokkal (VL) rendelkező egerek felhasználásával. A VL-t műtét vagy arzén indukálta. A VL szignifikánsan elnyomta az egerekben a HSHFD által fokozott testzsírt. HSHFD-vel táplált egerekben a VL javította a glükóz intoleranciát. A VL tompította az egerek epididimális fehér zsírszövetében a HSHFD által megemelkedett adipogén faktorok és gyulladásgátló adipokinek szintjét. A β-blokkoló antagonizálta a testzsírt és a glükóz intoleranciát, amelyet a HSHFD fokozott egerekben. Az RNS-szekvenálás elemzésének eredményei azt mutatták, hogy a HSHFD megváltoztatta a gének, például az inzulinszerű növekedési faktor-2 és a glia fibrilláris savas fehérje változását az egerek vestibularis magjaiban a vestibularis rendszeren keresztül. Összegzésképpen itt bemutattuk, hogy a vestibularis rendszer diszregulációja befolyásolja az egerekben a HSHFD által kiváltott elhízott állapotot és károsodott glükóz metabolizmust. A vestibularis rendszer hozzájárulhat a beállított pontok szabályozásához energiafelesleg esetén.

Bevezetés

A fej lineáris és szöggyorsulását a vestibularis hámsejtek érzékelik, majd a vestibularis neuronokon keresztül továbbítják a vestibularis magokba. A vestibularis magok neuronjai az egyensúlyérzékelés vezérlő központja, és a vestibularis rendszer kapcsolódik más neuronális traktusokhoz, például a vestibulo-oculomotorhoz és a vestibulo-spinalis traktusokhoz, amelyek vestibulo-okuláris reflexekkel és testtartással szabályozzák a szem tekintetét. [1,2]. Sőt, a vestibularis mag neuronjai kapcsolódnak az autonóm idegrendszerhez, és vestibulo-autonóm reflexként szabályozzák a kardiovaszkuláris rendszert [2,3].

A vestibularis rendszer és a csontváz szerveinek kapcsolatát illetően korábbi vizsgálatok azt mutatták, hogy a vestibularis elváltozások (VL) rágcsálókban a szimpatikus idegrendszeren keresztül csökkentik a csont ásványi sűrűségét (BMD) [4,5]. Luxa és mtsai. számoltak be arról, hogy a labirintektómia fokozta a myofiber remodelációját az egerek egyedüli izomzatában [6]. Nemrégiben kiderült, hogy a gravitációs változások az egerek vestibularis rendszerén keresztül érintik az izmokat és a csontokat [7,8]. Ezek a megállapítások együttesen azt sugallják, hogy a vestibularis rendszer részben a szimpatikus idegrendszeren keresztül szabályozza a mozgásszervi rendszert. A vestibularis rendszer diszfunkciói klinikailag szédülést, vertigo-t és bizonytalanságot okoznak [9]. A hosszú távú űrrepülés rontja az űrhajósok vestibularis rendszerét, akik ortosztatikus intoleranciát és bizonytalanságot tapasztalnak [3]. Azonban a vestibularis rendszer szerepe a metabolikus homeosztázisban még nem került részletesen tisztázásra.

A felesleges energia a fehér zsírszövetben (WAT) lipidként tárolódik, és elhízást okoz, ami a cukorbetegség kockázati tényezője [10]. Az adipociták megkülönböztetik a mezenhimális őssejteket, és az adipogén differenciálódás aktiválódását a peroxiszóma proliferátor által aktivált γ (PPARγ), aP2, hosszú láncú acil-CoA szintetáz (ACSL) 1 és lipoprotein lipáz (LPL) fokozott szintje követi. Elhízás esetén a WAT gyulladásgátló adipokineket, például tumor nekrózis faktor (TNF) -α, plazminogén aktivátor inhibitor (PAI) -1 és monocita kemoattraktáns fehérjét (MCP) -1, szabadít fel, amelyek károsítják a glükóz anyagcserét az alacsony fokú szisztémás gyulladás [10]. A zsírszövetből felszabaduló adiponektin és leptin pleiotróp hatást fejt ki a glükóz metabolizmusában [10]. A keringő adiponektin és a WAT-ból előállított leptin negatívan és pozitívan viszonyul a zsírtömeghez, [11,12] Korábbi eredmények azt mutatták, hogy az aktivált hipotalamusz leptin/melanokortin rendszer, a csökkent adiponektin szint és a hiperinsulinémia fokozza a szimpatikus idegi aktivitást az elhízásban [13–15].

Jelen vizsgálatunkban a VL hatását és hatásmechanizmusát vizsgáltuk az elhízásra és a glükóz metabolizmusának károsodására magas szacharóz/magas zsírtartalmú étrend (HSHFD) táplált elhízott egereknél, műtét és mérgező vegyi anyagok által indukált VL-vel, hogy tisztázzuk a a vestibularis rendszer az étrend okozta elhízásban és a glükóz metabolizmusának károsodásában.

Anyagok és metódusok

Etikai nyilatkozat

Valamennyi állatkísérletet az Országos Egészségügyi Intézet irányelveinek, valamint a Kindai Egyetemen a laboratóriumi állatok használatára és gondozására vonatkozó intézményi szabályoknak megfelelően hajtották végre. Valamennyi eljárást a Kindai Egyetem Kísérleti Állatvédelmi Bizottsága hagyta jóvá (Engedély száma: KAME-27-029). Minden erőfeszítést megtettek a szenvedés minimalizálása érdekében. Az egereket felesleges izofluránnal eutanizáltuk.

Állatkísérletek

A hím C57BL/6J egereket a CLEA Japan-tól (Tokió, Japán) vásároltuk. Az egereket ad libitumban HSHFD-vel (a kalóriák 28% -át szénhidrátokból és 55% -ot zsírból, Keleti élesztőből, Tokióból, Japánból) vagy normál étrendből (ND) és 9 hetes vízből tápláltuk 4 vagy 8 hétig. 6 órás éhezés után az egereket felesleges izofluránnal eutanizáltuk, és szövetmintákat gyűjtöttünk.

Sebészeti vestibularis elváltozások (sVL)

A hím C57BL/6J egereket (7 hetesek) véletlenszerűen 4 csoportba osztottuk: ND/Sham (n = 8), ND/sVL (n = 8), HSHFD/Sham (n = 8) és HSHFD/sVL = 8 ). A VL műtétet kétoldalúan, a korábban leírt módszer szerint végeztük egereknél 2% izoflurán altatásban [7]. Röviden, a fülcsontokat eltávolítottuk a külső hallójáraton keresztül. Az előcsarnok sérülést okozott, ha egy fogzúzót behelyeztek a belső fül ovális ablakába, majd cautery készülékkel ablálták. A VL-műtétnek a vestibularis rendszerre gyakorolt hatásait egy úszási teszttel értékeltük, amint azt korábban leírtuk [23], amelyben a vestibularis diszfunkcióval rendelkező egerek nem tudtak úszni, és továbbra is megfordultak a meleg víz (35 ° C) alatt. Az ál-egereknél a dobhártyát eltávolították, de a fülcsontok és az előcsarnok megmaradtak. 2 hetes gyógyulási periódus után az egereket 8 hétig ND-vel vagy HSHFD-vel etették.

Arzén által kiváltott vestibularis elváltozások (aVL)

A hím C57BL/6J egereket (9 hetesek) véletlenszerűen 4 csoportba osztottuk: ND/Kontroll (n = 8), ND/aVL (n = 8), HSHFD/Control (n = 8) és HSHFD/aVL = 8 ). A nátrium-arzanilátot alkalmazó VL-t kétoldalúan indukáltuk a korábban leírt módszerrel [24]. 2% izoflurán érzéstelenítés alatt 10 μl nátrium-arzanilátot (Tokyo Chemical Industry, Tokió, Japán) sóoldatban oldva injektáltunk a középfül üregébe (1,5 mg/fül). Kontroll egerekben azonos térfogatú sóoldatot injektáltunk kétoldalúan. Az egereket ND-vel vagy HSHFD-vel etettük az aVL-kezelés után 1 naptól számított 4 héten keresztül.

Propranolol kezelés

A hím C57BL/6J egereket 4 csoportra osztották: ND/Kontroll (n = 8), ND/propranolol (n = 8), HSHFD/Kontroll (n = 8) és HSHFD/propranolol (n = 8). A propanololt (Sigma, St. Louis, MO, USA) 9 hetes egereknek adtuk be ivóvízzel 0,5 g/l koncentrációban, 8 héten keresztül, a korábban leírtak szerint [8].

Glükóz és inzulin tolerancia tesztek

Glükózt (Wako, Osaka, Japán) 1,5 g/kg-ban és inzulint (Eli Lilly Japan, Kobe, Japán) 0,5 E/kg-ban adtunk intraperitoneálisan egereknek glükóz- és inzulin-tolerancia tesztekhez. A vércukorszintet az injekció beadása előtt és 30, 60, 90 és 120 perccel azután mértük.

A tapadás szilárdságának mérése

Az egerek tapadási szilárdságát ötször mértük meg egy tapadási szilárdságmérővel (1027SM, Columbus Instruments, Columbus, OH, USA), és a kapott eredményeket átlagként fejeztük ki, amint azt korábban leírtuk [25].

Kvantitatív számítógépes tomográfia (QCT)

Miután az egereket 2% izofluránnal altattuk, QCT-vizsgálatot végeztünk röntgen CT-rendszer (Latheta LCT-200; Hitachi Aloka Medical, Tokió, Japán) felhasználásával, a következő paraméterekkel: 500 μA csőáram, 50 kVp csőfeszültség és 48 mm-es axiális látómező, az előzőekben leírtak szerint [7]. A teljes zsír- és izomtömeg, valamint az összes csont ásványianyag-tartalom (BMC) elemzése során CT-képeket (voxelméret 96 × 192 × 1008 μm) nyertünk, és az érdeklődési körzetet az egész testként határoztuk meg. A tibialis trabecularis és corticalis BMD elemzése során 24 μm izotróp voxel nagyságú CT-képeket kaptunk, és az érdeklődési körzeteket 1680 μm-es szegmensként definiáltuk 96 μm-től a proximális növekedési lemez diafízis felé vezető végétől disztálisig és 2160-ig. a diaphysis középső szakaszának μμ-os szegmensei, ill. A CT-képeket LaTheta szoftverrel elemezték (3.41 verzió).

Szövettani elemzés

Az epididymális WAT-ot 4% paraformaldehidben rögzítettük 24 órán át, paraffinba ágyazva és 4 μm vastag szakaszokra vágtuk. A metszeteket hematoxilinnal és eozinnal festettük, és mikroszkóppal (E800; Canon, Tokió, Japán) fényképeztük CCD kamerával. Legalább 350 adipocita keresztmetszetét planimetriával számszerűsítettük ImageJ alkalmazásával, vak módon.

Valós idejű PCR elemzés

A teljes RNS-t az RNeasy Mini kit (Qiagen, Hilden, Németország) segítségével extraháltuk a gyártó utasításainak megfelelően. A cDNS-t nagy kapacitású cDNS reverz transzkripciós készlet alkalmazásával szintetizáltuk (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Valós idejű PCR-analízist végeztünk egy ABI PRISM 7900HT (Thermo Fisher Scientific) és Fast SYBR Green Master Mix (Thermo Fisher Scientific) alkalmazásával, a korábban leírtak szerint [25]. A valós idejű PCR-hez használt primereket az S1 táblázatban mutatjuk be. A célgének relatív mRNS-szintjét a methodCt módszerrel elemeztük, és 18S rRNS-szintekkel normalizáltuk.

Vérkémia

A szérum inzulin, leptin és adiponektin szintjét egér inzulin enzimmel kapcsolt immunszorbens vizsgálati készlet (AKRIN-011T katalógusszám, FUJIFILM Wako Shibayagi, Gunma, Japán), egér/patkány leptin Quantikine ELISA készlet (Cat. MOB00, R&D systems, Minneapolis, MN, USA), illetve egér/patkány adiponektin enzimmel kapcsolt immunszorbens vizsgálati készlet (katalógusszám: AKMAN011, FUJIFILM Wako Shibayagi), ill.

RNS szekvenálás

Egymilliméter vastag koronaszeleteket kaptunk egér agyából egér agymátrix segítségével (Muromachi Kikai, Tokió, Japán). A vestibularis magokat lyukasztóval gyűjtöttük össze az Allen Mouse Brain Atlas szerint [26]. A teljes RNS-t biopsziás mintákból TRIzol-reagenssel (Thermo Fisher Scientific) extraháltuk, és egy Agilent Bioanalyzer segítségével értékeltük az RNS 6000 Pico Kit (Agilent, Santa Clara, CA, USA) alkalmazásával. Az rRNS kimerülését és a könyvtárszintézist a NEBNext rRNS Depletion Kit (E6310, New England Biolabs, Ipswich, MA, USA) és a NEBNext Ultra Directional RNS Library Prep Kit (E7420, New England Biolabs) felhasználásával végeztük 500 ng teljes RNS-ből. A könyvtár minőségét az Agilent Bioanalyzer segítségével ellenőriztük a DNS nagy érzékenységű készletével (Cat. No. 5067–4626, Agilent). Minden könyvtárat Illumina (2 × 36 bp páros végű olvasás) és NextSeq500 High Output Kit v2 (Illumina, San Diego, CA, USA) segítségével szekvenáltunk. A FASTQ fájlokat a CLC Genomics Workbench-be (10.1.1-es verzió, Qiagen, Germantown, MD, USA) importálták. Az olvasmányokat mm10 egér referenciagenomra térképeztük fel, és 49 585 annotált génre számszerűsítettük. A transzkriptum kilobázisonkénti olvasása millió leképezett olvasás (RPKM) értékét kvantilis módszerrel normalizáltuk.

Statisztikai analízis

Az adatokat átlagként ± az átlag standard hibáiként fejezzük ki. A jelentős különbségeket kétirányú varianciaanalízissel elemeztük, amelyet Tukey-Kramer teszt követett. A 0,05 alatti P értékeket szignifikánsnak tekintettük. A statisztikai elemzéseket GraphPad PRISM 7.00 (GraphPad Software, San Diego, CA, USA) alkalmazásával végeztük.

Eredmények

Az sVL hatása a HSHFD által kiváltott elhízásra

A testtömeg, a teljes zsírtömeg és az adipocita nagysága az epididymális WAT-ban szignifikánsan magasabb volt a HSHFD-vel táplált egerekben, mint az ND-vel táplált egerekben (1A. És 1B. Ábra). Az sVL szignifikánsan csökkentette a testtömeget, a teljes zsírtömeget és a zsírsejtek méretét, amelyet a HSHFD fokozott, de nem befolyásolta a kalória-bevitelt HSHFD-vel vagy anélkül (1A. és 1B. ábra). Az sVL elnyomta az HSSFFD által fokozott ACSL1 mRNS-szinteket az egerek epididimális WAT-jában (1C. ábra), míg a HSHFD nem befolyásolta a PPARγ, aP2 vagy LPL mRNS-szintjét az egerek epididimális WAT-jában (1C. ábra). A teljes izomtömeg szignifikánsan alacsonyabb volt a HSHFD-vel táplált egerekben, és az sVL szignifikánsan csökkentette a teljes izomtömeget HSHFD-vel vagy anélkül (1D. Ábra). Noha a HSHFD-etetés nem befolyásolta a tallus és a gastrocnemius izmok szöveti tömegét vagy az egerek tapadásának erejét, az sVL jelentősen csökkentette a gastrocnemius izom szöveti súlyát ND- vagy HSHFD-vel táplált egerekben (1D ábra). Ami a csontot illeti, a HSHFD 8 héten át tartó etetése nem befolyásolta az egerek teljes BMC-jét vagy tibialis trabecularis és corticalis BMD-jét (1E. Ábra). Az sVL szignifikánsan csökkentette az összes BMC-t és a tibialis trabecularis BMD-t ND-vel és HSHFD-vel táplált egerekben (1E ábra).