Az 1,25-dihidroxi-kolekalciferol megelőzi és enyhíti a kísérleti egérgyulladásos bélbetegség tüneteit

Margherita T. Cantorna, Carey Munsick, Candace Bemiss, Brett D. Mahon, 1,25-dihidroxi-kolekalciferol megelőzi és enyhíti az egér kísérleti gyulladásos bélbetegségének tüneteit, The Journal of Nutrition, 130. évfolyam, 2000. november 11., 2648–2652. Oldal, https://doi.org/10.1093/jn/130.11.2648

ABSZTRAKT

Anekdotikus adatok arra utalnak, hogy a D-vitamin mennyisége, amely napsütés vagy étrend hatására elérhető a környezetben, fontos tényező lehet az emberek gyulladásos bélbetegségének (IBD) kialakulásában. A D-vitamin hipotézisét az IBD kísérleti állatmodelljében teszteltük. Az interleukin (IL) -10 knockout (KO) egereket, amelyek spontán módon fejlesztik ki az emberi IBD-hez hasonló tüneteket, D-vitamin-hiányt, elegendő D-vitamint vagy aktív D-vitamint (1,25-dihidroxi-kolekalciferol) egészítették ki. A D-vitamin-hiányos IL-10 KO egereknél gyorsan hasmenés és pazarló betegség alakult ki, ami mortalitást váltott ki. Ezzel szemben a D-vitamin-elegendő IL-10 KO egereknél nem alakult ki hasmenés, nem pusztult el vagy pusztult el. Jelentősen (P) 50 NE kolekalciferol (5,0 μg/d) vagy 1,25-dihidroxi-kolekalciferol (0,005 μg/d) kiegészítése

A perifériás vér mononukleáris sejtjeiben található D-vitamin receptorok azonosítása felkeltette a korai érdeklődést a D-vitamin, mint immunrendszer-szabályozó iránt (Bhalla et al. 1983; Provvedini et al. 1983). Különösen a CD4 + Th sejtek rendelkeznek D-vitamin receptorokkal, ezért a D-vitamin célpontjai (Veldman et al. 2000). Hormonálisan aktív D-vitamin [1,25-dihidroxi-kolekalciferol; 1,25 (OH) 2D3] legalább két kísérleti autoimmun betegség kialakulását elnyomta (Cantorna és mtsai 1996 és 1998a). In vitro az 1,25 (OH) 2D3 gátolta a T-sejtek proliferációját, és csökkentette az interleukin (IL) -2, az interferon (IFN) -y és a tumor nekrózis faktor (TNF) -α termelését (Lemire és Adams 1992). In vivo 1,25 (OH) 2D3 injekciókról kimutatták, hogy gátolják az 1. típusú helper T (Th1) sejtválaszhoz kapcsolódó késleltetett típusú túlérzékenységi reakciót (Lemire és Archer 1991, Lemire 1992). A D-vitamin az immunrendszer és a T-sejtek specifikus szabályozója.

Az IBD esetében az immun által közvetített támadás a GI traktus ellen irányul (Niessner és Volk 1995, Podolosky 1991). T-sejtekről, amelyek előnyösen termelik a Th1 citokineket (IL-2, IFN-γ és TNF-α), kimutatták, hogy a Crohn-szerű tünetek átkerülnek a naiv egerekre (Aranda és mtsai 1997, Bregenholt és Claesson 1998), és A Th1 citokinek termelése emberben is összefüggésbe hozható az IBD-vel (Niessner és Volk 1995). Az 1,25 (OH) 2D3 kezelésről kimutatták, hogy elnyomja más T-sejtek által közvetített kísérleti autoimmun betegségek (szklerózis multiplex és ízületi gyulladás; Cantorna és mtsai 1996 és 1998a) kialakulását. Tesztelték azt a hipotézist, hogy a D-vitamin (1,25-dihidroxi-kolekalciferol termelésével) elnyomja az IBD kialakulását és progresszióját.

A közelmúltban számos olyan transzgénikus állatot fejlesztettek ki, amelyeknél az IBD tünetei spontán jelentkeznek. A Crohn-betegség egyik legjobb állatmodellje az IL-10 knockout (KO) egér (Kuhn et al. 1993, Mac Donald 1994). A hagyományos állattartó létesítményekben az IL-10 KO egerek az élet 5–8 héten belül enterokolitist fejlesztenek ki (Kuhn és mtsai 1993). Az IL-10 KO egerek körülbelül 30% -a pusztul el súlyos vérszegénység és súlyvesztés kialakulása után (Kuhn és mtsai. 1993). Az IL-10 KO egerekben kialakuló enterocolitis a hagyományos mikroflóra elleni kontrollálatlan immunválasznak köszönhető, mivel a csíramentes IL-10 KO egerekben nem alakul ki betegség. Ezenkívül a specifikus kórokozóktól mentes létesítményekben nevelkedett egereknél enyhébb betegség alakul ki, ami nem eredményezi az egerek pusztulását (Kuhn et al. 1993). Vannak korlátozások az IL-10 KO egerek IBD modelljeként történő tanulmányozásában. Ha a D-vitamin az IL-10 termelésének szabályozója, akkor ebben az állatmodellben szereplő eredmények nem feltétlenül jelentenek „normális” immunválaszt. A Crohn-kórban szenvedő betegek azonban hasonló tüneteket mutatnak, depressziósak az IL-10 termelésben, és sikeresen kezelik őket IL-10-vel (Narula et al. 1998).

ANYAGOK ÉS METÓDUSOK

A Pennsylvaniai Állami Egyetem tenyésztelepén életkor és nem szerint egyeztetett C57BL/6 IL-10 KO és vad típusú (WT) egereket állítottak elő; a tenyészpárokat a Jackson Laboratory-ból (Bar Harbor, ME) szereztük be. A Pennsylvaniai Állami Egyetem állattartó létesítményei specifikus kórokozóktól mentesek, ezért az IL-10 KO egerek tenyésztése sikeres volt. Az összes leírt eljárást a Pennsylvaniai Állami Egyetem Intézményi Állattenyésztési és Felhasználási Bizottsága vizsgálta felül és hagyta jóvá 1999.01.25-én, IACUC # szám: 98118-A0.

Fogyókúrák

A kereskedelmi célú egér-táplálékkal táplált tenyész nőstények egyetlen csoportjából (# 5105 Ralston Purina; Richmond, IN) a terhesség 2. hétében lévő nőstényeket választották ki, és véletlenszerűen osztották szét két csoportba. A terhes anyák D-vitamin-hiányos étrendjének etetése biztosította, hogy az elválasztott állatok 5 hét korukra D-vitamin-hiányban szenvedjenek (Cantorna et al. 1996). Valamennyi egeret a laboratóriumban készített szintetikus táplálékkal etették [[Yang és mtsai. 1993], Smith és mtsai. (1987)]. Az egereknél D-vitamin-hiány volt, D-vitamin elegendő vagy 1,25 (OH) 2D3 volt kiegészítve. Az egereket sárga fény alatt helyeztük el, hogy megakadályozzuk a D-vitamin szintézisét a bőrben. Az egerek elválasztásáig D-vitamin-hiányban szenvedtek.

A 3 hetes D-vitamin-hiányos egereket véletlenszerűen különféle kezelési csoportokba soroltuk az alábbiakban leírtak szerint. Mivel más kísérleti autoimmun betegségek 1,25 (OH) 2D3 kezelése akkor volt a leghatékonyabb, ha magas volt az étkezési kalciumszint (1 g/100 g étrend), minden egeret magas kalciumtartalmú étrenddel tápláltak (Cantorna et al. 1999). A kísérleti étrendeket frissen készítették, és a kísérlet során 2-3 naponta cserélték ki. Annak biztosítása érdekében, hogy az 1,25 (OH) 2D3-val kezelt egerek elfogyasszák az összes rendelkezésre álló kiegészítőt, 8 g étrendet tartalmazó étkezési csészéket minden másnap minden második nap (teljesen elfogyasztottak) cseréltek az egyes kísérletek idejére (Cantorna et al. 1996 és 1998a) . A D-vitamin toxicitás monitorozásához naponta 1,25 (OH) 2D3-adalékkal kiegészített egereket figyeltek meg a hiperkalcémia jelei, beleértve az általános egészségi állapotot és a fogyást.

D-vitamin kezelések.

Az 1. kísérletben a 3 hetes D-vitamin-hiányos egereknek vagy fenntartották a D-vitamin hiányát, vagy átálltak a kísérleti étrendre, amely 5,0 μg kolekalciferolt/d tartalmazott (elegendő D-vitamin). Az IBD kialakulásának súlyosságát összehasonlítottuk D-vitamin-hiányos és D-vitamin-elegendő egerekben.

A 2. kísérletben a 3 hetes D-vitamin-hiányos egereket két csoportra osztottuk. Az egerek egyik csoportját a D-vitamin-hiányos étrenden tartották, a másik csoportot pedig 0,005 μg/d 1,25 (OH) 2D3-mal egészítették ki. A D-vitamin-hiányos és 1,25 (OH) 2D3-kiegészített egereket 4 hét múlva, 9 hétesen megölték.

A 3. kísérletben az 1,25 (OH) 2D3 kezelést az IBD tüneteinek első jeleinél (hasmenés, 7 hetes kor) kezdték meg. A 7 hetes D-vitamin-hiányos egereket két csoportra osztották. Az egyik csoport fenntartotta a D-vitamin hiányát, a másik csoport 0,2 μg/d 1,25 (OH) 2D3-mal egészült ki. Az egereket 2 hétig kezeltük, és a 9 hét idősebb egereket megöltük.

Élelmiszer-korlátozás.

A D-vitamin-hiányos IL-10 KO egerek drámai súlyvesztése és pusztulása miatt kontrollált etetési kísérleteket hajtottak végre. Ezek a kísérletek három egércsoportot használtak. E kísérletekhez tartozó összes egeret D-vitamin-hiányban tartották fenn az élet első 5 hétében (a fogyás legkorábbi jelei). 5 hét múlva a D-vitamin-hiányos IL-10 KO egereket két csoportra osztották. Az egerek felének D-vitamin-hiánya fennmaradt, a másik fele pedig D-vitamin-elegendő étrendre váltott, amely 5,0 μg/d kolekalciferolt tartalmazott. Ezenkívül a D-vitamin-hiányos WT egerek egy csoportját szintén 5,0 μg/d kolekalciferolt tartalmazó étrendre váltották. A D-vitamin-hiányos IL-10 KO egerek által elfogyasztott ételt naponta lemérték, és a D-vitamin-elegendő IL-10 KO és WT egereket korlátozott étrendben táplálták, amely tartalmazta a D-vitamin-hiányos IL-10 által elfogyasztott étel mennyiségét. KO egerek az előző 24 órában, hogy ellenőrizzék a táplálékfelvételt.

Szérum mérések.

Az egereket 5 hetes korukban és a kísérletek végén elvéreztük a hemoglobin-, kalcium- és vörösvértest-szám meghatározásához. 2 hétenként szérumot kapunk, és a szérum kalciumot mértük (az egerek normál értéke 2,00–2,75 mmol/l). A D-vitamin hiányát szérum kalciumanalízissel is monitorozták (szérum kalcium Kuhn et al. 1993). Az SI ürmagját 100 g/l formalinban, PBS-oldatban mentettük el, és elküldtük a Pennsylvania Állami Diagnosztikai Laboratóriumba, szekcionálásra és festésre hematoxi-alinnal és eozinnal. Minden egérből négy vagy több paraffinmetszetet (4 μm) pontoztak Kuhn és munkatársai által leírt pontos eljárással. (1993). A szakaszokat eredetük ismerete nélkül a 0–5 skálán értékelték a gyulladásra vonatkozóan az alábbiak szerint: 0, nincs gyulladás, 1, néhány gyulladásos sejt; 2, enyhe gyulladás; 3, tályogképződés; 4. ábra: tályogképződés sok gyulladásos sejt mellett; és 5, hatalmas gyulladás az egész szakaszon.

Statisztikai analízis.

A kísérleteket szükség szerint megismételtük; ahol lehetséges, az értékeket több kísérlet átlagaként jelentették. Kétmintás vizsgálatot alkalmaztunk binomiális arányokhoz az 1. ábrán bemutatott százalékos értékek statisztikai elemzéséhez, a leírtak szerint (Rosner 1986). A testtömegeket és a súlygyarapodásokat ismételt ANOVA-mérésekkel elemeztük egyszerű kontrasztok alkalmazásával az étrendcsoportok összehasonlításához (fő hatások). Az adatokat kétirányú ANOVA-nak vetettük alá, diétát és IL-10 genotípust használva csoportosítási tényezőként. Az összes post-hoc többszörös összehasonlítást Fisher által védett legkevésbé szignifikáns különbségteszt alkalmazásával végeztük. Az értékeket egy statisztikai program (Statview Student, Abacus Concepts, Berkeley, CA) segítségével hasonlítottuk össze a Macintosh számítógépen, és a P különbségei Az 1. ábra azt mutatja, hogy a D-vitamin-hiányos IL-10 KO egerek 7 hetes korban kezdenek elpusztulni. 9 hétesen a D-vitamin-hiányos IL-10 KO egerek 58% -a (15/26) elhunyt. 9 hét után a D-vitamin-hiányos IL-10 KO egerek tovább pazarlódtak, és a halálozási arány növekedett. Ezzel szemben a D-vitamin - elegendő IL-10 KO (n = 10) és a D-vitamin hiányos WT (n = 20) egerek egészségesnek tűntek, még 13 hetes korban is.

A D-vitamin-hiányos IL-10 KO egerek növekedését késleltették a D-vitamin-elegendő IL-10 KO és a D-vitamin-hiányos WT egerekhez képest (2. ábra). A D-vitamin-hiányos WT egerek lassabban nőttek, mint a D-vitamin-elegendő IL-10 KO egerek, de 12 hetes korukban a D-vitaminban elegendő IL-10 KO és a D-vitamin-hiányos WT egerek nem különböztek egymástól. 6 hét múlva és azt követően a D-vitamin-hiányos IL-10 KO egerek növekedése leállt, és lényegesen kisebbek voltak, mint a D-vitamin-hiányos WT egerek (2. ábra). 9 hetes korában a D-vitamin-hiányos IL-10 KO egerek kevesebbet kezdtek enni, és a következő 3 hét alatt gyorsan fogytak a további súlyok. Az ezt követő kísérleteket 9 hetes időtartamon belül befejeztük az IL-10 KO egerek felesleges fájdalmának és szenvedésének megelőzése érdekében. A D-vitamin-hiányos IL-10 KO egerek egy pusztító betegség után pusztultak el, amelyet hasmenés előzött meg.

A D-vitamin hisztopatológiája - elegendő és –hiányos IL-10 KO és WT egerek

Genotípus. n. D-vitamin státusz 1. Súly, g Szérum kalcium, mmol/L Szövettani pontszám .

IL-10 KO 2	7	−D	12,4 ± 2,3 *	1,74 ± 0,28 *	3,0 ± 0,2 *
IL-10 KO	7	1,25 (OH) 2D3	20,9 ± 0,8	3,00 ± 0,30	1,7 ± 0,4
WT	4	−D	16,7 ± 1,9 *	1,67 ± 0,32 *	0
WT	4	1,25 (OH) 2D3	21,1 ± 1,0	2,72 ± 0,25	0

Genotípus. n. D-vitamin státusz 1. Súly, g Szérum kalcium, mmol/L Szövettani pontszám .

IL-10 KO 2	7	−D	12,4 ± 2,3 *	1,74 ± 0,28 *	3,0 ± 0,2 *
IL-10 KO	7	1,25 (OH) 2D3	20,9 ± 0,8	3,00 ± 0,30	1,7 ± 0,4
WT	4	−D	16,7 ± 1,9 *	1,67 ± 0,32 *	0
WT	4	1,25 (OH) 2D3	21,1 ± 1,0	2,72 ± 0,25	0

Az összes egér D-vitamin-hiányos volt (-D) az élet első 5 hétében. 5 hét múlva az egereket két csoportra osztották; felét 0,005 μg/d 1,25 (OH) 2D3-mal egészítettük ki 4 hétig. Az értékek átlag ± SEM; * jelentősen különbözik a kiegészített pártól, P

IL, interleukin; KO, kiesés; −D, D-vitamin hiány; 1,25 (OH) 2D3, 1,25-dihidroxi-kolekalciferol; WT, vad típus.

A D-vitamin hisztopatológiája - elegendő és –hiányos IL-10 KO és WT egerek

Genotípus. n. D-vitamin státusz 1. Súly, g Szérum kalcium, mmol/L Szövettani pontszám .

IL-10 KO 2	7	−D	12,4 ± 2,3 *	1,74 ± 0,28 *	3,0 ± 0,2 *
IL-10 KO	7	1,25 (OH) 2D3	20,9 ± 0,8	3,00 ± 0,30	1,7 ± 0,4
WT	4	−D	16,7 ± 1,9 *	1,67 ± 0,32 *	0
WT	4	1,25 (OH) 2D3	21,1 ± 1,0	2,72 ± 0,25	0

Genotípus. n. D-vitamin állapota 1. Súly, g Szérum kalcium, mmol/L Szövettani pontszám .

IL-10 KO 2	7	−D	12,4 ± 2,3 *	1,74 ± 0,28 *	3,0 ± 0,2 *
IL-10 KO	7	1,25 (OH) 2D3	20,9 ± 0,8	3,00 ± 0,30	1,7 ± 0,4
WT	4	−D	16,7 ± 1,9 *	1,67 ± 0,32 *	0
WT	4	1,25 (OH) 2D3	21,1 ± 1,0	2,72 ± 0,25	0

IL, interleukin; KO, kiesés; −D, D-vitamin hiány; 1,25 (OH) 2D3, 1,25-dihidroxi-kolekalciferol; WT, vad típus.

A D-vitamin-hiányos és elegendő WT-egerek nem mutattak gyulladás vagy rendellenességeket az SI-ben. A D-vitamin-hiányos IL-10 KO egereknél szignifikánsan több volt a gyulladás az SI-ben, mint az 1,25 (OH) 2D3-val kiegészített vagy a D-vitaminnal megfelelő társaiknál (P 1. táblázat és az adatok nem láthatók). Bár a D-vitamin-hiányos IL-10 KO egerek mérete a legkisebb, a boncolás kimutatta, hogy rendkívül nagy SI-vel rendelkeznek. A jövőbeni kísérletek az SI súlyokat fogják tartalmazni, mint a gyulladás kvantitatívabb mérését az SI-ben.

Rövid távú 1,25 (OH) 2D3 kezelés és IBD súlyosság.

2 hetes 1,25 (OH) 2D3 kezelés után egyetlen egér tömegében sem volt szignifikáns különbség (az adatokat nem mutatjuk be). A D-vitamin-hiányos IL-10 KO egerek SI-je azonban megnövekedett és súlyuk lényegesen nagyobb volt (P 2. táblázat). Valójában a D-vitamin-hiányos IL-10 KO egerek SI-je a teljes testtömeg 9,9% -a volt, ami a normálérték duplája (2. táblázat). Az IL-10 KO egerek SI gyulladásának csökkenése már 2 hét 1,25 (OH) 2D3 kezelés után.

Az 1,25 (OH) 2D3 kezelés csökkenti az enterokolitist az IL-10 KO egerekben

Genotípus. n. D-vitamin státusz 1. Vékonybél . g. g/100 g test .

IL-10 KO 2	8.	−D	1,67 ± 0,04 *	9,9 ± 0,5 *
IL-10 KO	8.	1,25 (OH) 2D3	1,08 ± 0,05	5,4 ± 0,3
WT	12.	−D	0,97 ± 0,02	5,8 ± 0,2
WT	8.	1,25 (OH) 2D3	1,06 ± 0,04	5,3 ± 0,2

Genotípus. n. D-vitamin státusz 1. Vékonybél . g. g/100 g test .

IL-10 KO 2	8.	−D	1,67 ± 0,04 *	9,9 ± 0,5 *
IL-10 KO	8.	1,25 (OH) 2D3	1,08 ± 0,05	5,4 ± 0,3
WT	12.	−D	0,97 ± 0,02	5,8 ± 0,2
WT	8.	1,25 (OH) 2D3	1,06 ± 0,04	5,3 ± 0,2

Az egerek mindegyike D-vitamin-hiányos volt (-D) az élet első 7 hétében. 7 hetes korukban a D-vitamin-hiányos IL-10 KO egerekben az enterocolitis tünetei jelentkeznek (hasmenés és fogyás). A 7 hetes IL-10 KO és WT egereket két csoportra osztottuk; felét 0,2 μg/d 1,25 (OH) 2D3-mal egészítettük ki 2 hétig. Az értékek átlag ± SEM; * szignifikánsan nagyobb, mint az összes többi csoport, P