Az alacsony fehérjetartalmú étrend az egerekben a felnőtt utódok kardiovaszkuláris és anyagcsere-funkcióját érinti

Biológiai Tudományok Iskolája, Nottinghami Egyetem, Sutton Bonington Campus, Loughborough, Egyesült Királyság; és

Aston Egészséges Öregedés Kutatóközpontja, Élet- és Egészségtudományi Iskola, Aston Egyetem, Birmingham, Egyesült Királyság

Az újranyomtatási kérelmek és egyéb levelezés címe: A. J. Watkins, az Aston Egészséges Öregedés Kutatóközpontja, Élet- és Egészségtudományi Iskola, Aston Univ., Birmingham. B4 7ET, Egyesült Királyság (e-mail: [e-mail védett]).

Biológiai Tudományok Iskolája, Nottinghami Egyetem, Sutton Bonington Campus, Loughborough, Egyesült Királyság; és

Absztrakt

Habár az anyai környezet manipulálásának fejlődési következményeivel kapcsolatos megértésünk jól körülhatárolt, az apai fiziológia és a táplálkozási állapot hatása a fogamzás körül még mindig alulvizsgált. Embereken és egereken végzett vizsgálatok kimutatták, hogy a hím testtömeg-index (BMI) növekedése a spermiumok csökkent mozgékonyságával (19), a spermium rendellenességének megnövekedett előfordulásával (23) és a DNS-fragmentációval (11), valamint a terhesség csökkenésével jár (17). Egerekben az utódok metabolikus profilja, beleértve a máj lipid- és koleszterin bioszintézisét az elválasztáskor, a szérum glükóz, az IGF-1 és a kortikoszteron szintje megváltozik az apai LPD (9) vagy a várandós éhgyomorra (2) reagálva. A magas zsírtartalmú (27) vagy az energiatartalmú (36) étrend fogyasztása negatívan befolyásolja a spermiumok mozgékonyságát, a DNS integritását és a blasztociszta fejlődési sebességét, és rontja az utódok hasnyálmirigy β-sejtjeinek működését (28). Férfiaknál az apai elhízás összefüggésbe hozható a blasztociszta fejlődésének csökkenésével és az élő születési rátával (5), valamint a IGF2 differenciálisan metilált régió az újszülött gyermekek kordnövényében (42).

Bár ezek a tanulmányok a fiatal utódok metabolikus rendellenességeinek generációk közötti átadását spermium-közvetített mechanizmusok révén azonosítják, a felnőtt utódokra gyakorolt hatás a kardiovaszkuláris és metabolikus fenotípusra továbbra sem ismert. Ezért jelenlegi tanulmányunk célja az volt, hogy meghatározzuk az apai LPD hatását a felnőtt utódok jól meghatározható kardiovaszkuláris és metabolikus egészségének markereire, a felnőtt utódok vérnyomásának, az artériás funkciónak, az in vivo glükóztolerancia és az expresszió elemzésére összpontosítva. kardiovaszkuláris és metabolikus szabályozó gének.

Állatkezelések.

Valamennyi egeret és kísérleti eljárást az Egyesült Királyság Belügyminisztériumi Állattenyésztésről (Scientific Procedures) 1986. évi törvényével és a Nottinghami Egyetem helyi etikai bizottságával jóváhagyott protokollokkal hajtották végre. Szűz hím (9 hét öreg) és nőstény (5–9 hét öreg) C57BL/6 egereket (Harlan, Belton, Leicestershire, Egyesült Királyság) 2 hétig tartottunk a Nottinghami Egyetem biotámogató egységénél 07: 00–19: 00 között: 00 világos-sötét ciklus 20–22 ° C hőmérsékleten, ad libitum hozzáféréssel a chow-hoz (2018 Teklad Global 18% Protein Rodent Diet; Harlan) és a vízhez. A súlynak megfelelő hím egereket egyedileg helyeztük el, és kiosztottuk a kontroll normál fehérjetáplálékra (NPD; 18% kazein, 42,5% kukoricakeményítő, 21,3% szacharóz, 10% kukoricaolaj, 5% cellulóz; n = 8) vagy izokalorikus (kalóriában/gm) LPD (9% kazein, 48,5 kukoricakeményítő, 24,3% szacharóz, 10% kukoricaolaj, 5% cellulóz; n = 8) ad libitum [Speciális diétás szolgáltatások; korábban publikált kompozíció (24, 52)] 7 hétig a párzás megkezdése előtt, és a megfelelő étrenden tartották, amíg ki nem pusztult 32 hetes korukban (1. ábra).

A szűz, 7-9 hetes C57BL/6 nőstényeket egyenként NPD vagy LPD csapokkal ketrecbe tették, ad libitum hozzáféréssel a csapok megfelelő étrendjéhez. A hüvelyi dugó jelenlétét másnap reggel a párzás jelének vették. A pozitív pozitív nőstényeket egyedileg helyezték el, és az utódok elválasztásáig tartották őket az állaton, ekkor selejtezték őket. Születéskor megmérték az utódokat, és meghatározták az alom hím-nő arányát. Három hetes korukban az összes utódot elválasztották, és a nemeket alomonként külön-külön ketrecbe tették, a chow és a víz ad libitum hozzáférésével, valamint véletlenszerűen kiosztott, állandó markerrel ellátott farokjelekkel az egyének későbbi heti követésére. Minden utódot hetente lemértek születésüktől 24 hétig. Minden csap két-két almot generált; az előválasztás során azonban 2 NPD és 2 LPD alom, külön-külön ménesekből, elveszett az anyai csecsemőgyilkosság miatt. Mint ilyen, étrendi kezelésenként összesen 14 litert elemeztek.

Vérnyomásmérés.

A vérnyomást (szisztolés és diasztolés) és a szívfrekvenciát ménes hímeknél mértük 11 (prediet etetés), 17 (premating) és 27 hetes korban, és mindegyikük utódot generált mind a 14 alomból kezelési csoportonként (n = 42 NPD hím, 43 NPD nő, 27 LPD hím és összesen 42 LPD nő) 6, 10, 14 és 18 hetes korban, számítógépes, nem invazív, farok-mandzsetta rendszer használatával (Kent Scientific). Valamennyi egeret legalább 1 órán át a kísérleti helyiségbe akklimatizáljuk, majd legalább 30 percig 27-30 ° C-on melegítjük, majd a mérés előtt 5 percig a rögzítő és mérőberendezésbe helyezzük.

Glükóz tolerancia teszt.

Az utódok glükóztoleranciáját alomonként legalább egy hím és nősténynél határozták meg 22 hetes korban. Az utódokat egy éjszakán át éheztettük, ad libitum hozzáféréssel a vízhez, és közvetlenül a glükóz tolerancia teszt előtt lemértük őket. Helyi érzéstelenítő (EMLA krém, helyi érzéstelenítők eutektikus keveréke, lidokain/prilokain; AstraZeneca) beadása után az éhomi vércukorszintet egy farokérből kézi glükométerrel (Freestyle Optium) gyűjtött mintában határozták meg intraperitoneális glükóz előtt. bolus (2 g/testtömeg-kg PBS-ben). Vérmintákat gyűjtöttünk a farokvénából a 15., 30., 60. és 90. percben a glükóz koncentrációjának meghatározása céljából. Valamennyi állatot visszatértük eredeti ketrecükbe, ad libitum hozzáféréssel az élelemhez és a vízhez.

Mesenterialis artéria vazoreaktivitása.

Utódok (n = 8 pár hím és nőstény utód kezelési csoportonként, mindegyik pár külön alomból) vaszkuláris funkciót 24 hetes korban értékeltük izolált kis mesenterialis artériaszegmensekben, a korábban (51) leírtak szerint drót myográfon (Danish Myo Technology A/S ). A kumulatív koncentráció-válasz görbéket mértük az α1-adrenerg agonista fenilefrinre (10–9–10–4 mol/l), és az U46619 (10 mmol/l) tromboxán-utánzóval (10 mmol/l) végzett szubmaximális (EC80) szűkület után az ACod értágítók (10 –9–10–5 mol/l) és izoprenalin (Iso; 10–10–10–6 mol/l), valamint a nitrogén-monoxid (NO) donor-nátrium-nitroprusszid (SNP; 10–11–10–5 mol/l) )) sorrendben ugyanazokban az artériákban. Az összes gyógyszert a Sigma-tól (Egyesült Királyság) vásárolták.

Szövetmintavétel.

Az összes egeret méhnyak elmozdulásával selejteztük. 32 hetes korukban a ménes hímeket levágták, és a szívszúrással vett vérmintákat hagyták a jégen alvadni, mielőtt 10 000 fordulat/perc sebességgel, 4 ° C-on 10 percig centrifugálták, majd a szérumot alikvotálva és -80 ° C-on tárolták. C. A májat, a vesét, a szívet, a tüdőt, a herét és a retroperitoneális, gonadális, inguinalis és interscapularis zsírokat [anatómiai helyek, amelyeket korábban definiáltunk (52)] eltávolítottunk, lemértünk és -80 ° C-on tároltunk. A bal és jobb oldali caudalis epididymákat eltávolítottuk, és egy előmelegített 200 μl csepp spermium mozgási közegbe helyeztük (135 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2 és 30 mM HEPES; frissen kiegészítve 10 mM tejsavval, 1 mM nátrium-piruvát, 20 mg/ml BSA és 25 mM NaHCO3). Az epididymákat 23-as tűvel többször megvágták, és 15 percig 37 ° C-on hagyták, hogy a spermiumok kiúszhassanak. A motilitás értékelése előtt a spermiumokból vett mintát vettünk egy Neubeur számláló kamrával. Az összegyűjtött spermiumokat 2 ml előmelegített motilitási közegbe pipettáztuk, és 1 órán át 37 ° C-on hagytuk felúszni. A felső 1,5 ml tápközegben lévő spermiumokat összegyűjtöttük és a fentiek szerint megszámoltuk. 24 hetes korukban az utódokat vér és szomatikus szövetek gyűjtése céljából leölték (a fent leírtak szerint).

Metabolitok és hormonmérések.

A 32 hetes korban történő selejtezést követően a ménes szérum glükózját kereskedelmi glükóz-oxidáz vizsgálattal (Sigma), valamint a szérum inzulin és tesztoszteron szintjét ELISA módszerrel (Millipore, illetve R&D Systems) elemeztük. A vizsgálati teszteket homogenizáltuk (50 mM HEPES, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1% SDS) a fehérjeszint meghatározása előtt (DC assay, Bio-Rad Laboratories, CA, USA). A herék tesztoszteronszintjét kereskedelmi ELISA (R&D Systems) alkalmazásával határoztuk meg. Az adiponektin és a TNF-α szintjét utód szérumban, selejtezéskor határoztuk meg ELISA-val (R&D Systems). Valamennyi vizsgálatot a gyártó utasításainak megfelelően végeztük, és Benchmark mikrolemez-olvasón (Bio-Rad Laboratories) mértük.

RNS extrakció és transzkript expresszió.

Az RNS-t az RNeasy Mini Kit (Qiagen) segítségével az utódok szív- és májszövetéből nyertük ki a gyártó utasításainak megfelelően. A szennyező genomi DNS-t oszlopon lévő DNáz I emésztéssel távolítottuk el a cDNS szintézis előtt, az ImProm II kit (Promega) alkalmazásával, a mellékelt véletlenszerű primerek felhasználásával. Valós idejű PCR (RTqPCR) elvégzéséhez 1 μl (5 ng RNS-ekvivalens) cDNS-t adtunk egy mastermixhez, amely 10 μl mastermixet (2X Precision SYBRgreen Mastermix; PrimerDesign), 0,7 μl primer keveréket (5 μM előre és hátra alapozó) tartalmaz, és reakciónként 8,3 μl vizet. A cDNS helyett vizet használtunk mint sablon nélküli kontrollt. Az amplifikációt és a detektálást egy Lightcycler 480 (Roche) alkalmazásával és a LightCycler SW 1.5.lnk szoftverrel megszerzett adatokkal végeztük. Az amplifikáció utáni olvadási görbe megerősítette az egyes primerkészletek specifikus termékeinek jelenlétét. A Ct értékeket ΔΔ Ct módszerrel relatív expressziós értékekké alakítottuk, az utódok szívadataival normalizált Ppib és Sdha és a májadatok normalizálódtak Pgk1 és Tbp. A geNorm szoftvert (48) használtuk annak meghatározására, hogy ezek a legstabilabb referencia gének. Az alapozó szekvenciákat és az amplifikáció hatékonyságát az 1. táblázat tartalmazza.

1. táblázat: Valós idejű kvantitatív PCR példa részletek

Statisztikai elemzések.

Adott esetben a mén hím adatait független minták vagy ismételt mérések segítségével elemezték t-tesztek, a normalitás felmérését követően, és Pearson-korreláció a fenotípusos mérések közötti korreláció elemzéséhez (SPSS 17. verzió). Az utód alom nemi arányát binomiális teszt alkalmazásával elemeztük (SPSS 17. verzió). Az utódok vaszkuláris reakciókészségének elemzését a GraphPad Prism 6 alkalmazásával végeztük, ahol a log effektív koncentráció megegyezett a maximális válasz (pEC50) és a maximális válasz 50% -ával a koncentráció-válasz görbék független mintákkal elemezve t-teszt. Az összes többi utód adatait többszintű véletlenszerű hatások regressziós modell (SPSS 18. verzió) (53) alkalmazásával elemezték, figyelembe véve az alom apai eredetét, a terhességi alom méretét, az utód nemét és a testtömegét. Jelentőséget vettek fel a P 6 ± 2,30 × 106/ml; LPD, 11,62 × 10 6 ± 1,99 × 10 6/ml) vagy az úszás után összegyűjtött spermiumok száma (NPD, 4,99 × 10 6 ± 1,29 × 10 6/ml; LPD, 4,68 × 10 6 ± 0,72 × 10 6/ml) megfigyeltük a ménescsoportok között.

ÁBRA. 1.A normál fehérje étrend heti átlagos testtömege (NPD; ○; n = 8) és alacsony fehérjetartalmú étrend (LPD; ●; n = 8) ménes hímek. A kísérleti etetés 11 hetes korban kezdődött, és 32 hetes holtig folytatódott. A párzással táplált nőstények 18 hetes korban kezdődtek. A hibasávok SE. *P

Az apai LPD befolyásolja az utódok nemi arányát, születési súlyát és felnőttkori fenotípusát.

Az anya átlagos súlya a fogantatás előtt (16,28 ± 0,11 g) és a terhesség 2 hét után (23,80 ± 0,29 g) és az átlagos alomméret (5,7 ± 0,4) nem különbözött a kezelési csoportok között. A születéskor a hím kölykök aránya azonban csökkent az LPD-ben az NPD-kezelési csoporthoz képest (NPD, 0,54 ± 0,04; LPD, 0,40 ± 0,06; P = 0,03), és a hím utódok születési súlya nőtt (NPD, 1,26 ± 0,02 g; LPD, 1,33 ± 0,02 g; P = 0,05). Az LPD utódok súlyosabbak voltak, mint az NPD utódok 2 hetes korban (NPD, 6,54 ± 0,07 g; LPD, 7,13 ± 0,08 g; P = 0,006) és 3 hét (NPD, 7,82 ± 0,10 g; LPD, 8,61 ± 0,14 g; P = 0,019). Az elválasztáskor a nemeket külön-külön ketrecbe tették (3 NPD hím, 2 LPD hím, 3 NPD nőstény és 3 LPD nőstény átlag ketrecben), az NPD és az LPD utódok testtömegében további 24 hetes testtömeg-különbség nem volt megfigyelhető. életkor (az adatok nem láthatók).

A párzáskori apai fenotípus és az utódok korai posztnatális fejlődésének összefüggéseinek elemzése szignifikáns negatív összefüggéseket tárt fel az LPD ménes testtömege és az átlagos alom hím-nő arány között (r = −0,444, P

ÁBRA. 2.Szisztolés (A), diasztolés (B) és jelentése (C) vérnyomás és pulzus [ütés/perc (BPM); D] NPD (fehér sávok) és LPD (fekete sávok) utódokban 18 hetes korban. A hibasávok SE. *P

22 hetes korban mind a hím, mind a nőstény LPD utódok emelkedett vércukor-koncentrációt mutattak az intraperitoneális glükóz bolus után. Az injektálás utáni 15. és 60. percben az LPD hímeknél szignifikánsan magasabb volt a vércukorszint, 60 és 90 percnél csökkent a teljes clearance (a görbe alatti terület, AUC; P = 0,034, illetve 0,029) (3. ábraA). Az LPD nőstényeknek hasonlóan megemelkedett a vércukorszintje az injekció beadását követő 15. és 30. percben, és az általános clearance csökkent a 60. és a 90. percben (AUC; P = 0,022, illetve 0,080) (3. ábraB).

ÁBRA. 3.A vércukorszint átlagos változásai intraperitoneális glükóz bolust (2 g/testtömeg-kg) követően férfiakbanA) és nőstényB) NPD (○) és LPD (●) utódok 22 hetes korban. A hibasávok SE. *P

24 hetes korban szignifikánsan gyengített vazokonstriktív válaszokat (pEC50) az α-1 adrenerg agonista fenilefrinre (PE) és maximális értágító válaszokat Iso és NO donor SNP-re figyeltek meg LPD hímek artériáiban (4. ábraA, P

ÁBRA. 4.A izolált mesenterialis artériák átlagos vazoreaktivitása férfitól (A) és nőstényB) NPD (○) és LPD (●) utódok 24 hetes korban. A fenilefrin (PE) kumulatív addíciói és az előszűkítés után az ACh, izoprenalin (Iso) és nátrium-nitroprussid (SNP) értágítók. A hibasávok SE. *P

2. táblázat: Utódok szérum adiponektin és TNF-α koncentrációi

Nemi férfiak, nők jelentősége (P) DietNPDLPDNPDLPDDietSexDiet × SexAdiponektin, μg/ml8,82 ± 0,298,95 ± 0,3013,62 ± 0,2913,20 ± 0,29-

3. táblázat: Utódszövet transzkript expressziója

Szövet és GeneNPDLPDP ÉrtékSzív Adcy51,00 ± 0,020,93 ± 0,020,026 Fto1,00 ± 0,010,88 ± 0,02 A Nottinghami Egyetem Haladó Kutatási Ösztöndíja (A. J. Watkinsnak) és a Társaság a Szaporodásért és Termékenységért Akadémiai Ösztöndíj Alap díja (K. D. Sinclairnek).

A szerző (k) nem jelentenek be pénzügyi vagy egyéb összeférhetetlenséget.

Szerző közreműködései: A.J.W. a kutatás megtervezése és megtervezése; A.J.W. elvégzett kísérletek; A.J.W. és K.D.S. elemzett adatok; A.J.W. és K.D.S. értelmezett kísérletek eredményei; A.J.W. elkészített figurák; A.J.W. megfogalmazott kézirat; A.J.W. és K.D.S. szerkesztett és átdolgozott kézirat; A.J.W. és K.D.S. a kézirat jóváhagyott végleges változata.

KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS

Köszönjük Wing Yee Kwongnak a technikai segítséget és tanácsot.