Az elhízás az expresszió csökkenésével jár, de nem a termogenezissel kapcsolatos gének hipermetilezésével a zsírszövetekben

Absztrakt

Háttér

A termogenezis károsodása elősegítheti az elhízást. Ezért ennek a tanulmánynak az volt a célja, hogy megvizsgálja, hogy az elhízott egyének zsírszövetében megváltozik-e a termogenezissel kapcsolatos gének expressziója, és hogy a promótereik túlzott metilációja részt vesz-e ebben a jelenségben.

Mód

A β adrenerg receptorokat kódoló gének expressziója (ADRB-k), a pajzsmirigyhormon receptorok (THR-ek), 5’-jodtironin-jód-dinázok (DIO-k) és a szétkapcsolódó fehérjék (UCP-k) valós idejű PCR-rel mértük zsigeri és szubkután zsírszövetekben 58 elhízott (BMI> 40 kg/m 2) és 50 vékony (BMI 20-24,9 kg/m 2) egyénnél. Ezen gének metilációs állapotát a metilációra érzékeny emésztés/valós idejű PCR módszerrel vizsgáltuk.

Eredmények

A kifejezés ADRB2, ADRB3, THRA, THRB, 2. RÉSZ, UCP2 szignifikánsan alacsonyabb volt az elhízott betegek zsírszövetében, mint a normál testsúlyú egyének szöveteiben (

Háttér

Az energiafogyasztás és a ráfordítás közötti egyensúlyhiány az elhízás egyik fő oka [1]. Mivel a jelenleg rendelkezésre álló nem invazív elhízási kezelések többsége hosszú távon hatástalan, új terápiás stratégiákat kell kidolgozni a túlzott zsírosodás csökkentése érdekében [2].

Számos bizonyíték áll rendelkezésre arra vonatkozóan, hogy a termogenezissel összefüggő utak zavarai szerepet játszhatnak az elhízás kialakulásában. A korai epidemiológiai vizsgálatok kimutatták, hogy az elhízott egyének energiafelhasználása alacsonyabb; ez az adaptív termogenezis alacsonyabb hatékonyságával magyarázható [13]. Ennek a hipotézisnek az igazolására számos állatkivágást hoztak létre, különféle termogenezissel kapcsolatos gének szelektív ablációjával; e vizsgálatok eredményei azonban kétértelműek voltak, és aláhúzták a termogenezist szabályozó mechanizmusok összetettségét [14-18]. Vizsgálatokat végeztek a termogenezis különböző aktivátorainak az elhízás kezelésében történő felhasználásáról is, és jelenleg számos új termogén vegyületet vizsgálnak, például szintetikus és szelektív pajzsmirigyhormon-receptorokat vagy β-adrenerg receptor agonistákat [19].

Eddig keveset tudunk az elhízott emberek zsírszövetében a termogenezissel összefüggő utak fiziológiai változásairól, és ezek az ismeretek döntő kapcsolatot jelentenének a in vitro kísérletek és farmakológiai vizsgálatok. Ebben a munkában megmutatjuk, hogy több termogenezissel összefüggő gén expressziója alacsonyabb az elhízott egyénekből származó zsírszövetekben, mint a nem elhízott vizsgálatban résztvevők szöveteiben, és hogy ezen gének expressziós szintje valószínűleg nem függ össze a metilációs státussal promótereik közül.

Mód

Zsírszövet

A zsigeri (VAT) és a szubkután (SAT) zsírszövetekből tizenhat mintát nyertünk 58 elhízott páciensből (testtömeg-index (BMI) súlyként (kg) számítva osztva a négyzetmagassággal (m 2),> 40 kg/m 2 ) bariatrikus műtét során. Ötven kontrollszövetet gyűjtöttünk normál testsúlyú betegektől (BMI 20-24,9 kg/m 2), akiket elektív cholecystectomián (VAT, N = 22) végeztek, vagy lágyéksérv miatt műtötték (SAT N = 28). A gyűjtést követően a mintákat folyékony nitrogénben azonnal lefagyasztották és -80 ° C-on tárolták. A projektet a Varsói Orvostudományi Egyetem Bioetikai Bizottsága jóváhagyta (KB/47/2009 határozat), és minden résztvevőtől írásos beleegyező nyilatkozatot kaptak a tanulmányban való részvételhez.

Alapvető biokémiai paraméterek

Az elhízott egyének szérumában/plazmájában alapvető biokémiai és hormonális paramétereket mértek a Varsói Orvostudományi Egyetem Jézus Csecsemő Oktató Kórházának diagnosztikai laboratóriumában, rutin eljárás szerint.

Nukleinsavak izolálása, reverz transzkripció és valós idejű PCR

Körülbelül 500 mg szövetet homogenizáltunk folyékony nitrogénben, és az összes RNS-t és DNS-t TRIzol Reagenssel (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) extraháltuk a gyártó eljárása szerint. Minden RNS-ből száz nanogrammot használtunk a RevertAid First Strand cDNS szintetikus készlettel (Fermentas, Vilnius, Litvánia) végzett reverz transzkripcióhoz a gyártó protokollja szerint. A kapott cDNS-t RNS-mentes dH2O-ban hígítottuk (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Ezután 1 μl cDNS-t használtunk, amely 0,5 ng teljes RNS-nek felel meg, sablonként a LightCycler 480 Instrument II (Roche, Mannheim, Németország) LightCycler 480 Sybr Green I Master Kit (Roche, Mannheim, Németország) valós idejű PCR-ben. )) és specifikus primerekkel (1. kiegészítő fájl: S1. táblázat). A PCR-körülmények a következők voltak: kezdeti inkubálás 95 ° C-on 10 percig, 40 ciklus 95 ° C-os 12 másodpercig, 58-62 ° C-on 12 másodpercig, 72 ° C-ig 12 másodpercig, majd egy olvadási görbe-ciklus. Az összes mérést három példányban hajtottuk végre. Az eredményeket normalizáltuk a β-aktin gén (ACTB) és tetszőleges egységekben (AU) mutatják be átlagos mRNS-szintként, valamint a Fold Change (FC = 2 -ΔΔCt) átlagos kifejezéseként, tekintve, hogy az FC szignifikáns, ha 1,50 (up-reguláció).

Metilezési elemzés

Statisztikai analízis

Az mRNS expressziójának különbségeit a Statica szoftver v.10 (StatSoft, Tulsa, OK) szoftvercsomaggal értékeltük a Student t/Mann-Whitney U tesztjével vagy Kruskal-Wallis varianciaanalízissel. A kvantitatív értékek közötti összes korrelációt a Spearman-korrelációs teszttel hajtottuk végre. Az eloszlás normalitását és a variancia homogenitását Shapiro-Wilk, illetve Levene tesztjeivel ellenőriztük. A hamis pozitív eredmények minimalizálása érdekében a Bonferroni korrekciót alkalmazták többszörös tesztelésre, és a szignifikancia szintet 0,01-ben állapították meg.

Eredmények

Tanulmányozott csoportok

Az elhízott személyek csoportja 49 nőstényből és 9 férfiból állt. Alapvető klinikai jellemzőiket, biokémiai paramétereiket és pajzsmirigy-állapotukat az 1. táblázat foglalja össze. A metabolikus szindrómát 48-nál (82,7%) diagnosztizálták az európaiakra vonatkozó Nemzetközi Diabetes Szövetség kritériumai alapján [www.idf.org]. Valamennyi 2-es típusú diabetes mellitusban szenvedő és ≥ 60 ml/perc glomeruláris filtrációs sebességű (GFR) beteget metforminnal vagy metformin és szulfonilureák kombinációjával kezeltünk, míg a GFR-ben szenvedő személyeket 1. táblázat A vizsgálatban résztvevők kiválasztott klinikai és biokémiai paraméterei

A kontroll csoport 40 nőst és 10 férfit tartalmazott. A kolelithiasison és az inguinalis hernián kívül semmilyen krónikus betegség nem volt kórelőzményük, beleértve a metabolikus szindróma és a pajzsmirigy betegségeit. Normál egészségi állapotukat fizikai vizsgálat és vérvizsgálatok igazolták (1. táblázat). Bár zsírszövet-tartalmukat nem számolták, anamnézisük, BMI-értékeik és biokémiai paramétereik alapján metabolikusan egészségesnek tekintették őket.

A vizsgálati alanyoktól nem kaptunk részletes étrendi kérdőívet; a tipikus menük alapján végzett számítások azonban azt mutatták, hogy elhízott egyéneknél az átlagos napi kalóriabevitel nőknél legalább 1000-1500 kcal, a férfiaknál 1500-2000 kcal túllépte az energiaigényt. Minden elhízott személy ülő életmódot folytatott.

A termogenezissel kapcsolatos gének expressziója elhízott és vékony egyedek zsírszövetében

Tíz gént vontak be a vizsgálatba: ADRB1, ADRB2 és ADRB3 kódoló adrenerg receptorokat β1, β2 és β3, 1. RÉSZ és 2. RÉSZ kódoló 1-es és 2-es típusú 5’-jodtironin-jód-dinázokat, THRA és THRB a pajzsmirigyhormon receptorokat kódoló α és β, és UCP1, UCP2, UCP3 az 1., 2. és 3. szétkapcsolódó fehérjét kódoló kezdeti elemzés azt mutatta, hogy e gének átlagos expressziója nem különbözött a hímek és a nők zsírszöveteiben; ezért minden elemzést mindkét nem esetében együtt végeztek.

A. Expressziójának elemzése ADRB2 (1B. Ábra) és ADRB3 (1C. Ábra) azt mutatta, hogy átlagos mRNS-szintjük szignifikánsan alacsonyabb volt az elhízott betegek zsírszövetében, mint a normál testsúlyú kontrollok szöveteiben (P 1. ábra

A kifejezés kifejezésének összehasonlítása ADRB1 (A), ADRB2 (Zenekar ADRB3 (C) gének az elhízott (O) és a normál testsúlyú (N) egyének zsigeri (VAT) és szubkután (SAT) zsírszöveteiben. Eredmények, normalizálva a ACTB, átlag ± szórásként mutatjuk be.

Az átlagos kifejezése 2. RÉSZ (2B. Ábra) elhízott betegek zsírszövetében szignifikánsan alacsonyabb volt, mint a kontroll csoportban (P 2. ábra

A kifejezés kifejezésének összehasonlítása 1. RÉSZ (A), 2. RÉSZ (B), THRA (C), és THRB (D) elhízott (O) és normál testsúlyú (N) egyének zsigeri (VAT) és szubkután (SAT) génjei. Eredmények, normalizálva a ACTB, átlag ± szórásként mutatjuk be.

Az átlagos kifejezése UCP2 (3B. Ábra) elhízott betegek zsírszövetében szignifikánsan alacsonyabb volt, mint normál testsúlyú egyéneknél (P 3. ábra

A kifejezés kifejezésének összehasonlítása UCP1 (A), UCP2 (B), és a UCP3 (C) gének az elhízott (O) és a normál testsúlyú (N) egyének zsigeri (VAT) és szubkután (SAT) zsírszöveteiben. Eredmények, normalizálva a ACTB, átlag ± szórásként mutatjuk be.

Az FC kifejezést alkalmazó alternatív elemzés (2. táblázat) megerősítette a fentebb leírt különbségeket a fentiekben ADRB2, ADRB3, 2. RÉSZ, THRA, THRB és UCP2 mRNS szintek.

A kísérleteket a zsírszövet teljes homogenizátumain végeztük. Azonban az a megállapítás, hogy két BAT-specifikus gén átlagos expressziója, UCP1 és PPARG (3. ábra és 3. kiegészítő fájl: S1. Ábra), minden elemzett szövetben hasonló volt, azt jelenti, hogy a termogenezissel kapcsolatos gének expressziójának különbségei nem a bézs adipociták eltérő tartalmának köszönhetők.

Összefüggés az elhízott egyének zsírszövetéből származó termogenezissel kapcsolatos gének expressziója és a klinikai, biokémiai, valamint hormonális paraméterek között

A vizsgált gének expressziós szintjei korreláltak az alapvető klinikai (BMI, a zsírszövet százalékos aránya, a derék kerülete), a biokémiai (éhomi szérum glükóz, összkoleszterin, alacsony sűrűségű lipoproteinek, nagy sűrűségű lipoproteinek, trigliceridek és C-reaktív fehérje koncentrációk), valamint a hormonális (pajzsmirigy-stimuláló hormon, szabad tiroxin, szabad trijód-tironin) paraméterek. Nem találtunk szignifikáns összefüggést.

A termogenezissel kapcsolatos gének szabályozó régióinak metilezése a zsírszövetekben

A kérdéses gének metilációs állapotának elemzését egy in silico szabályozási régióik elemzése a CpG Islands Searcher (www.cpgislands.com) és a CpG Plot (http://www.ebi.ac.uk) segítségével. Hatból ötből gének expressziós szintje szignifikánsan különbözik az elhízott és karcsú egyéneknél, nevezetesen az ADRB2, ADRB3, THRA, THRB, és 2. RÉSZ, az elemzés feltárta a CpG-szigetek jelenlétét promótereikben. Ezt követően minden egyes génhez 22 DNS-mintát használtak, 11-et alacsony, és 11-et e gén magas expressziójú szöveteket. Az alacsony expressziójú szövetekben a metiláció átlagos szintje hasonló volt a metiláció szintjéhez azokban a szövetekben, amelyek mindegyikének magas expressziója volt jelen. Az expresszió és a metiláció szintjei között nincs összefüggés (4. ábra). Ezenkívül az egyes gének átlagos metilációs szintje hasonló volt VAT és SAT szempontjából. Végül az érdeklődő gének átlagos metilációs szintje hasonló volt elhízott és karcsú betegeknél; a karcsú betegek szöveteinek száma azonban csak 5 volt, és ennek az elemzésnek a statisztikai ereje alacsony volt.

A kifejezés kifejezés összefüggése ADRB2 (A), ADRB3 (B) , 2. RÉSZ (C), THRA (D) és THRB (E) a promótereik metilációs státusával. A vörös pontok magas, míg a fekete mintákat mutatnak, a vizsgált gén alacsony expresszióval.

Vita

Ebben a munkában megmutatjuk, hogy több termogenezissel kapcsolatos gén átlagos expressziója szignifikánsan alacsonyabb az elhízott betegekből származó zsírszövetekben, mint a sovány egyedek szöveteiben. Azt is javasoljuk, hogy ez a jelenség valószínűleg nem kapcsolódik a promótereik differenciális metilezéséhez.

A mai napig keveset tudunk a termogén aktivitás különbségeiről az VAT és a SAT között. Az a megállapítás, hogy a „bézs” adipociták túlnyomórészt az emberi SAT-ban vannak jelen, arra utalhat, hogy meghatározó szerepe van a termogenezisben [40], és alátámasztja az epidemiológiai és kísérleti adatokat, amelyek arra utalnak, hogy a megnövekedett szubkután zsír alacsonyabb anyagcsere-komplikációk kockázatát hordozza, mint a viszcerális zsír [41]. . Megállapításunk, hogy a kifejezés 2. RÉSZ, ADRB2 és ADRB3 elhízott személyeknél az áfa szignifikánsan alacsonyabb volt, mint a SAT-ban, az alacsonyabb lipolitikus és termogén potenciálra utalhat, ami megerősíti a korábbi vizsgálatokat.

Következtetések

Legjobb tudomásunk szerint az itt bemutatott bizonyítékok elsőként mutatják be, hogy az elhízott egyének zsírszöveteit a termogenezis aktiválásában szerepet játszó kulcsgének csökkent expressziója jellemzi. Ennek alapján azt javasoljuk, hogy az elhízott egyének zsírszövete kevésbé reagáljon mind a hormonális, mind az adrenerg ingerekre, és ezért kevésbé valószínű, hogy aktiválja a termogenezist, mint sovány egyéneknél.