Ex situ Az étrend befolyásolja a vörös szemű levelibékák bőrével társult baktériumközösséget (Agalychnis callidryas)

Csatlakozási Élettudományi Kar, Manchesteri Egyetem, Manchester, Egyesült Királyság

Kapcsolatok Élettudományi Kar, Manchesteri Egyetem, Manchester, Egyesült Királyság, Ökológiai Tudományok Tanszék, Vrije Universiteit Amsterdam, Amszterdam, Hollandia

Társulások Élettudományi Kar, Manchesteri Egyetem, Manchester, Egyesült Királyság, FrogLife, Peterborough, Egyesült Királyság

Társulás Chesteri állatkert, Chester, Egyesült Királyság

Csatlakozási Élettudományi Kar, Manchesteri Egyetem, Manchester, Egyesült Királyság

Rachael E. Antwis,
Rachel L. Haworth,
Daniel J. P. Engelmoer,
Victoria Ogilvy,
Andrea L. Fidgett,
Richard F. Preziosi

Ábrák

Absztrakt

Idézet: Antwis RE, Haworth RL, Engelmoer DJP, Ogilvy V, Fidgett AL, Preziosi RF (2014) Az ex situ diéta befolyásolja a vörös szemű levelibékák (Agalychnis callidryas) bőrével társult baktériumközösséget. PLoS ONE 9 (1): e85563. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0085563

Szerkesztő: Gabriele Berg, Graz Műszaki Egyetem (TU Graz), Ausztria

Fogadott: 2013. október 7 .; Elfogadott: 2013. december 3 .; Közzétett: 2014. január 9

Finanszírozás: Ezt a munkát a Biotechnológiai és Biológiai Tudományok Kutatási Tanácsának REA-val történő ösztönzése támogatta. A finanszírozóknak nem volt szerepük a tanulmányok tervezésében, adatgyűjtésben és elemzésben, a közzétételre vonatkozó döntésben vagy a kézirat elkészítésében.

Versenyző érdeklődési körök: A szerzők kijelentették, hogy nincsenek versengő érdekek.

Bevezetés

A szimbiotikus baktériumközösségek általában állatokkal és növényekkel együtt találhatók. Gyakran a baktériumközösség bizonyos előnyöket nyújt a gazdaszervezetek számára kölcsönös előnyök fejében, például tápanyagok és megfelelő mikrohabitát élni és szaporodni [1], [2]. A baktériumok sokfélesége fontos szerepet játszik a közösség stabilitásának és rugalmasságának meghatározásában az olyan belső vagy külső zavarokkal szemben, mint a stressz, a környezeti változás vagy a kórokozók általi invázió [3] - [6]. Például Dillon és mtsai. [6] szignifikáns inverz kapcsolatot mutatott ki a sáska bél (Schistocerca gregaria) fajgazdagsága és a kórokozó baktériumok (Serratia marcescens) szaporodása között, valamint a fertőzött egyedek számának jelentős csökkenését és a baktériumközösség növekedését. sokféleség.

Egyre több kutatás bizonyítja, hogy a kétéltűek bőrével társult baktériumközösség befolyásolhatja a gazdaszervezet hajlamát számos fertőző betegségre (pl. Ref [1], [2], [7] - [12]). A kétéltűek bőrével társult baktériumok megvédhetik a gazdaszervezetet a patogén fertőzéstől azáltal, hogy: a) növekvő verseny a helyért és az erőforrásokért; b) a kétéltű bőr mikrokörnyezetének megváltoztatása a kórokozók kolonizációjának megakadályozása érdekében, és c) antimikrobiális anyagok termelése, amelyek elpusztítják vagy gátolják a kórokozók növekedését [1], [11], [13]. Például Woodhams et al. [9] megállapította, hogy a Rana sierrae populációban, a Batrochochytrium dendrobatidis (Bd; a kétéltű chytrid gomba) jelenlétében a Yosemite Nemzeti Parkban (USA) lényegesen több egyén volt, akiknek legalább egy anti-Bd baktérium törzs társult a bőrükhöz, mint egy közeli populáció Rana muscosa, amely naiv volt a chytrid gomba iránt, majd kihalt, amikor Bd elterjedt a területen. Lam és mtsai. [12] összehasonlította ugyanezt az R. sierrae populációt egy másik, Bd-nél na- gyobb R. muscosa populációval a térségben, és hasonló arányú egyedeket talált minden populációban, amely legalább egy anti-Bd baktérium törzsnek adott otthont, és ezt az R. populációt. A muscosa sikerült megmaradni, amikor a chytrid gomba egy évvel később megérkezett.

Jelenleg vizsgálják az anti-Bd baktériumok potenciális probiotikus védekezésként való alkalmazását a chytrid gomba ellen [14]. Bebizonyosodott, hogy a potenciális probiotikus baktériumok sikeresen megtelepedhetnek a kétéltűek bőrén, közvetlenül és a környezetből történő átvitel útján, a bőrön az anti-Bd metabolitok későbbi növekedésével, valamint a Bd zoosporák expozíciójának jelentős növekedésével és növekedésével. 15] - [17]. Ezenkívül különféle tejsavat termelő baktériumokat különítettek el, amelyek természetesen előfordulnak az amerikai kecskebékákon (Lithobates catesbeianus), és az in vitro vizsgálatok azt mutatják, hogy a fogságban élő populációk ezekkel a baktériumokkal történő beoltása képes megakadályozni és/vagy kezelni a bakteriális szeptikémiát, akár külön-külön, akár nem. több törzsű probiotikumként [18] - [21]. Ezért a kétéltűek bőrén a baktériumok megfelelő együttesének jelenléte valószínűleg fontos a fertőző betegségek elleni védelemben.

A vadon élő kétéltűek viszonylag nagy mértékben vannak kitéve a baktériumoknak a környezeti átvitel (pl. Növények, talaj, víz), valamint kölcsönhatások révén mind a fajtársakkal (pl. Anyai vagy apai átadás, mind a párzás során történő átvitel) és más fajokkal [2], [22] - [24]. Ezzel szemben a fogságban élő kétéltűek szinte biztosan kevesebb egyedgel lépnek kapcsolatba, valamint kevésbé változatos és heterogén környezetet tapasztalnak, amelyen keresztül baktériumokat nyerhetnek. Ennek eredményeként a fogságban élő kétéltűek valószínűleg kisebb mértékben vannak kitéve számos baktériumnak, ezért a vadon élő társaikkal összehasonlítva egyszerűbb bőrbaktériumok közösségszerkezetét támogatják, így a vadakba való újbóli bejuttatáskor kevésbé ellenállóak a betegségekkel szemben. A szerző tudomása szerint jelenleg nincsenek olyan publikációk, amelyek összehasonlítanák az ugyanazon faj fogságban tartott és vadon élő populációinak natív mikroflóráját.

A fogságban tartott különböző tartási körülmények (étrend, szubsztrát, dúsítás stb.) Szintén valószínűleg befolyásolják a mikrobiális közösséget. Meyer és mtsai. [25] megállapította, hogy a hűvösebb hőmérséklet (10–20 ° C) megnövelte a nád varangyok (Rhinella marina) bőrfelületének gyakoriságát, összehasonlítva a melegebb hőmérsékletekkel (20–30 ° C), és hogy a bőr lecsúszása csökkent baktériumok a bőrön. Ez azt jelzi, hogy a fogságban lévő körülmények közvetetten befolyásolhatják a baktériumok közösségét, bár a különböző tartási gyakorlatok közvetlen hatásait még vizsgálni kell. Ahhoz, hogy a probiotikus kezelések eredményesek legyenek, nagyobb ismeretekre van szükség a bőr baktériumközösségeinek fogságban tartásának lehetséges hatásairól.

A gazda tápláltsági állapota két okból is befolyásolhatja a jelenlévő baktériumközösséget; a) a baktériumok valószínűleg felhasználják a kétéltűek bőrnyálkájában található tápanyagokat; és b) vannak bizonyítékok arra vonatkozóan, hogy egy kétéltű bélje a bőrbaktériumok tárolóként működik [2], [26], [27]. Számos kétéltű faj lenyeléskor lenyeli a bőrét, ezáltal a bőrbaktériumokat is beveszi, amelyeket aztán a kloakán keresztül újra be lehet oltani a bőrre [27]. Az étrend kimutatta, hogy befolyásolja a baktériumok közösségét, amely számos rovarfaj és más gazdaszervezetek béljéhez kapcsolódik, beleértve a szivárványos pisztrángot (Oncorhynchus mykiss), a Galapagos iguanákat (Amblyrhynchus cristatus, Conolophus subscristatus és Conolophus pallidus) és az embereket [28] - [32]. A kétéltűek étrendje valószínűleg befolyásolja a baktériumok túlélését a bélrendszerben, ezért befolyásolja a bőrre újra beoltott közösséget. Ez megváltoztathatja a probiotikus kezelések sikerességét, valamint a fogságban élő kétéltűek, valamint a vadonba visszaengedettek veszélyeztetettebbé vagy rezisztensebbé válhatnak a kórokozók által okozott fertőzésekkel szemben.

A kétéltűek egészségét érdeklő egyik táplálkozási szempont az étrendi karotinoidok [33], [34]. A gerinceseknél a karotinoidokat kizárólag az étrendből nyerik, és antioxidánsként hatnak a szervezetben, valamint az A-vitamin prekurzoraként [35]. Ezenkívül a karotinoidok számos organizmusban vörös, narancs és sárga színt kölcsönöznek, beleértve a békákat is [36], [37]. A vadonban a kétéltűek az etető rovarok széles skálájához férnek hozzá, amelyekből karotinoidokat nyerhetnek, míg a fogságban tartott kétéltűeket általában gerinctelenekkel táplálják, amelyekben hiányos a karotinoidok száma [34]. Az etető rovarok fogságban történő bélterhelésével növelhető a kétéltűek karotinoidjainak elérhetősége. A karotinoidokkal dúsított étrendet tápláló vörös szemű levelibékák (Agalychnis callidryas) bőrénél lényegesen nagyobb a vörös szín, mint a karotinoidmentes étrenddel tápláltaknál [34], ami azt jelzi, hogy az étrendi tápanyagok lerakódnak a bőrben, és ezért közvetlen hatásuk lehet hatása a bőr baktérium közösségére.

Itt tenyésztési módszerekkel hasonlítottuk össze a karotinoidokkal dúsított étrenddel és karotinoidmentes étrenddel táplált vörös szemű levelibékák (Agalychnis callidryas) bőrével társult bőrbaktériumok közösségét. A baktériumokat nemzetség/faj szintre is azonosítottuk 16S riboszomális DNS szekvenálás segítségével, és összehasonlítottuk azokat a tenyésztett baktériumokkal, amelyeket A. callidryas vadállományából gyűjtöttünk a Las Cuevas kutatóállomáson, Chiquibul Rainforest, Belize. Feltételeztük, hogy a vad A. callidryas nagyobb számú baktériumfajt támogat, mint a fogságban tartott A. callidryas, és hogy az izolált baktériumfajokban különbségek lesznek. Feltételeztük azt is, hogy a fogva tartott A. callidryas magas karotinoid diétával táplálkozva jelentősen nagyobb baktériumok sokféleségét támogatja, mint a karotinoidmentes étrendet fogyasztók.

Mód

Etikai nyilatkozat

Ezt a tanulmányt a Manchesteri Egyetem Etikai Bizottsága és az Észak-Angliai Zoológiai Társaság (Chesteri Állatkert) Etikai Bizottság hagyta jóvá, és minden módszer nem invazív volt. A baktériumokat összegyűjtötték és kivitték az Agalychnis callidryas vadállományából a Belize Forest Department engedélyével (kutatási és exportengedély száma CD/60/3/12), és a DEFRA engedélyével (TARP/2012/224 engedélyszám) importálták őket az Egyesült Királyságba.

Baktériumos mintavétel fogságban lévő békákból

Tizenhét fogságban tenyésztett A. callidryát (F1, kedvtelésből tartott állatokból származó) fekete tücskökkel (Gryllus bimaculatus) tápláltak bélben, magas vagy karotinoid-diétával (5,0 mg/g; n = 10; 5 hím, 5 nő) vagy karotinoiddal. -mentes étrend (0,0 mg/g; n = 7; 4 férfi, 3 nő) (az étrend részleteit lásd [34]). Valamennyi béka ugyanabból a petefészekből származott, és metamorfózis esetén véletlenszerűen egy étrendi kezelési csoportba sorolták őket. Így a baktériumok közösségében megfigyelt különbségek csak az étrend különbségeinek tulajdoníthatók. Megjegyezzük, hogy ez a tervezés a baktériumközösségek közötti különbségeket teszteli egy adott mintavételi ponton, nem pedig azt, hogy a baktériumközösségek hogyan változnak az idők során a karotinoidok étrendbe történő hozzáadására reagálva.

Adatkonvertálás és statisztikai elemzés

Baktériumminta vadbékákból

Nyolc A. kallidriát (négy hímet, négy nőstényt) gyűjtöttek az elegáns tótól a Las Cuevas kutatóállomáson, a chiquibuli esőerdőben, Belize-ben (északi szélesség 16 ° 43′, 88 ° 59′W), egyenként műanyag zacskókba tették, és visszatették kutatóállomás. Ezután mindegyik békát leöblítették és felpörgették a karotinoid diétás vizsgálati állatoknál leírtak szerint. A tamponokat tartalmazó csöveket erőteljesen rázogattuk 30 másodpercig, majd a tartalmat R2A agarlemezekre öntöttük, amelyeket parafilm borított be, és a baktériumokat környezeti hőmérsékleten nyolc napon át hagytuk növekedni. A mintákat nem hígítottuk 10-1-re (mint a fogságban tartott békák esetében), hogy minimalizáljuk a baktériumok szántóföldi tenyésztéséhez szükséges lépések számát. Mivel ennek célja a vadon élő és a fogságban tartott békákkal társult baktériumok azonosságának összehasonlítása volt, nem valószínű, hogy ennek jelentős hatása lenne az eredményekre. Steril tamponokat használtunk az egyes morfotípusok reprezentatív telepeinek kiválasztásához, amelyeket 1 ml R2A húsleves tápközeget tartalmazó, csavaros tetejű csövekbe helyeztünk. A csöveket ezután a Manchesteri Egyetemre (Egyesült Királyság) szállították, ahol a csövek tartalmát friss R2A agarlemezekre öntötték és 25 ° C-on inkubálták, amíg a baktériumok szaporodtak. Ezeket azután újracsíkoltuk, hogy biztosítsuk a tiszta tenyészetet.

Molekuláris módszerek és szekvenálási elemzések

Eredmények

Az étrendi karotinoidok hozzáférhetőségének hatása a bőr baktérium közösségére

Karotinoidokkal dúsított étrenddel táplált békákból egyedenként 8–13 morfotípust különítettek el, egyedenként 6–11 morfotípust izoláltak karotinoidmentes étrenddel táplált békákból. Az étrend, a nem és az étrend × a nemek közötti interakció Adonis-modellje azt mutatta, hogy az étrendnek jelentős hatása volt a békákhoz kapcsolódó összes baktériumközösségre (F1.13 = 2.868, p = 0.024), de a nem (F1.13 = 0.815, p = Étrend × nem (F1.13 = 0.733, p = 0.618) nem. Ezt követően a nemet eltávolítottuk a modellből, így az étrend jelentős hatást gyakorolt a teljes baktériumközösségre (F1,15 = 2841, p = 0,014).

A hibasávok ± 1 S.E.M. A * szignifikáns különbséget jelöl.

A hibasávok ± 1 S.E.M. A * szignifikáns különbséget jelez.

A Morphotype azonosságokat a GenBank belépési száma jelzi; a részleteket lásd az 1. táblázatban. A hibasávok ± 1 S.E.M.

A fogságban élő és a vadon élő populációk közötti különbségek a baktériumfajokban

Az 1. táblázat mutatja a fogságban és vadon élő A. callidryas-ból izolált egyes baktériumfajokat. 12 család huszonegy morfotípusát izolálták az A. callidryas vad populációiból. Tizenhárom különféle bakteriális morfotípust (hat család) izoláltak a karotinoidokkal dúsított étrenddel táplált békákból, tizenegyet (öt család) pedig karotinoidmentes étrenddel táplált békákból. Mind a vad, mind a fogságban élő populációkból csak egy baktériumfajt izoláltak (Stenotrophomonas sp.; A fogságban lévő A. callidryasból izolálták a karotinoid-étrendet), bár a fogságban lévő békákból izolált három baktériumfajt a gyenge szekvenciaadatok miatt nem sikerült azonosítani, és telepeket már nem áll rendelkezésre az egyenlőtlenség számára. Két domináns baktériumcsaládot izoláltak a vad és fogságban tartott A. callidryas-ból; Enterobacteriaceae és Staphylococcaceae (1. táblázat). E két család esetében több fajt izoláltak a vadon élő békáktól, mint fogságban (nyolc kontra kettő és három kontra kettő).

Vita

Az étrendi karotinoidok hozzáférhetőségének hatása a bőr baktérium közösségére

A karotinoid-étrendű békák bőrének megnövekedett baktériumgazdagsága a karotinoidmentes étrendű békákkal összehasonlítva azt sugallja, hogy a karotinoidok jelenléte javíthatja a baktériumok növekedését és/vagy túlélését mind a bélben, mind a bőrön. Az Agalychnis callidryák leváláskor lenyelik a bőrüket (Antwis, pers. Obs.). A karotinoidok étrendben való nagyobb hozzáférhetősége a baktériumok védelmét is elősegítheti, amikor áthaladnak a belekben, ezáltal lehetővé téve számukra a bőr újbóli beoltását. Például egyes baktériumok karotinoidokat használnak, hogy megvédjék a DNS-t, a fehérjéket és a sejtmembránokat a reaktív oxigénfajok által okozott károsodásoktól, amelyek a gazdatest metabolikus folyamatai során keletkeznek [35], [40]. Wiggins és mtsai. [27] ugyanazokat a baktériumfajokat izolálta a P. cinereus béléből és bőréből, és hasonló baktérium nemzetségek találhatók az R. catesbiana és az R. pipiens béljében, mint más kétéltű fajok bőrén, köztük A. callidryák ebben a vizsgálatban (pl. az Acinetobacter, Aeromonas, Bacillus, Citrobacter, Enterobacter, Flavobacterium, Klebsiella, Micrococcus, Pseudomonas és Serratia nemzetségek fajai) [41] - [43]. Ez azt sugallja, hogy a kétéltűek bőrével és béljével társuló baktériumközösségek hasonló eredetűek, és képesek befolyásolni egymás összetételét.

A vadon élő és a fogságban tartott békák közötti baktériumok különbségei

A vad A. callidryas-ból sokkal nagyobb számú baktériumot izoláltak, mint a fogságban lévőket. Rendszertani hasonlóságok mutatkoztak a vadon élő és a fogságban élő populációkból izolált baktériumfajok között családi és nemzetségi szinten. Mindkét populációból azonban csak egy baktériumfajt izoláltak (Stenotrophomonas sp.), Bár a fogságban lévő békák három morfotípusát a gyenge szekvenciaadatok miatt nem sikerült azonosítani. Érdekes módon a fogságban levő és a vadon élő békák között elterjedt egyetlen fajt csak a karotinoidokkal dúsított táplálékkal táplált fogságban tartott békáktól izolálták, bár viszonylag alacsony bőségben. Tekintettel arra, hogy mind a közösség egésze, mind pedig egyes baktériumfajok valószínűleg részt vesznek a gazdaszervezet védelmében az invazív kórokozóktól, ez kihatással lehet a fogságban lévő békák azon képességére, hogy megvédjék magukat a kórokozóktól, mind fogságban. és a vadonba történő újratelepítéssel kapcsolatban, és különös jelentőséggel bírhat a kétéltűek ex situ megőrzésével járó hosszú távú védelmi projektek esetében.

Következtetések

Ez a tanulmány azt mutatja, hogy a karotinoidokkal dúsított étrend jelentősen növeli az A. callidryas bőrével kapcsolatos baktériumok gazdagságát és bőségét. Tekintettel a bőrbaktériumok szerepére a kétéltűek betegségmegelőzésében, annak bizonyítéka, hogy a fogságban lévő körülmények jelentősen befolyásolhatják a baktériumközösséget, kihatással lehetnek a probiotikus kezelések sikerességére, valamint befolyásolhatják a kétéltűek újrakezdésre való alkalmasságát. Kimutattuk azt is, hogy a fogságban tartott békák eltérõ és csökkent baktériumközösséget támogatnak az azonos fajú vadbékákhoz képest. További munkára van szükség annak érdekében, hogy meghatározzuk a többi fogságban élő betegségnek a kétéltűekkel társult baktériumközösségekre gyakorolt hatásait, valamint a mikrobiotában bekövetkező változásokat a vadból a fogságba történő átvitelre adott válaszként, különös tekintettel a betegségekkel szembeni rezisztenciára és a probiotikus sikerre gyakorolt hatásokra.

Köszönetnyilvánítás

A szerzők köszönetet mondanak David Springate-nek és John Fitzpatrick-nak az R.-ben végzett elemzésekhez nyújtott segítségükért. Különösen hálásak vagyunk Paul Johnstonnak és Andres Arce-nak azért, mert felbecsülhetetlen értékű tanácsokat adtak a tanulmány kezdeti tervezéséhez, valamint Christopher Michaels-nek, aki észrevételeket adott a tervezetekhez. ennek a papírnak. Lisa Andrejczak mindennap ellátta a békákat.

Szerző közreműködései

A kísérletek megtervezése és megtervezése: REA RLH DJPE VO ALF RFP. Végezte a kísérleteket: REA RLH. Elemezte az adatokat: REA RFP. Írtam a dolgot: REA.