Az M1 és M2 zsírszövet makrofágok szabályozási mechanizmusai étrend okozta elhízott egerekben

Absztrakt

CÉLKITŰZÉS A zsírszöveti makrofágok (ATM) fenotípusos változásainak jellemzése az inzulinérzékenység különböző körülményei között.

KUTATÁSI TERVEZÉS ÉS MÓDSZEREK Az egér epididimális zsírszövetéből származó M1 és M2 makrofágok marker génjeinek számát és expresszióját áramlási citometriával elemeztük, miután az egereket magas zsírtartalmú étrendnek (HFD) és pioglitazon kezelésnek vetettük alá.

EREDMÉNYEK Az epididymális zsírszövetben a CD11c-pozitív M1 makrofágok és a CD206-pozitív M2 makrofágok többségét áramlási citometriával egyértelműen elválasztották. Az M1 és M2 makrofágok teljesen eltérő génexpressziós mintázatot mutatnak. Nemcsak az M1 ATM-ek számát és az M1 marker gének, például a tumor nekrózis faktor-α és a monocita kemoattraktáns protein-1 expresszióját, hanem az M1/M2 arányát is növelte egy HFD, és csökkentette a későbbi pioglitazon kezelés, ami utal a korrelációra a teljes test inzulinérzékenységével. Megállapítottuk azt is, hogy az M2 ATM-ek megnövekedett száma egy HFD után az interleukin (IL) -10, egy gyulladáscsökkentő Th2 citokin uregulált expressziójával társult az adipocita frakcióban, valamint a zsírszövetben. Az IL-10 adenovírus vektor általi szisztémás túlzott expressziója növelte az M2 markerek expresszióját a zsírszövetben.

KÖVETKEZTETÉSEK Az M1 és M2 ATM-ek a makrofágok különböző részhalmazait alkotják. Az inzulinrezisztencia mind az M1 makrofágok számával, mind az M1/M2 arányával összefüggésben van. HFD után az IL-10 fokozott expressziója szerepet játszhat az M2 makrofágok fokozott toborzásában.

Az elhízás és az inzulinrezisztencia szorosan összefügg a zsírszövet alacsony fokú gyulladásának állapotával, ahol a rezidens makrofágok fontos szerepet játszanak (1–9). A zsírszöveti makrofágok (ATM-ek) legalább két különböző fenotípusból állnak (azaz klasszikusan aktivált M1 makrofágokból és alternatív módon aktivált M2 makrofágokból). Egy nemrégiben készült jelentés (10) azt javasolta, hogy az M1 vagy M2 ATM-eket megkülönböztessék az M1 makrofág marker CD11c jelenléte vagy hiánya. Az M1 ATM-ek proinflammatorikus citokineket, például tumor nekrózis faktor (TNF) -α, interleukin (IL) -6 és monocita kemoattraktáns fehérjét (MCP) -1 termelnek, hozzájárulva ezzel az inzulinrezisztencia indukciójához (11–13). Másrészről az M2 ATM-ekről, amelyek a sovány zsírszövet fő rezidens makrofágjai, eltérő génexpressziós profilról számoltak be, amelyet a CD206, az argináz-1, az MglI és az IL-10 viszonylag magas expressziója jellemez, amelyek részt vesznek a szövetek javításában vagy átalakításában (10–14).

A legújabb tanulmányok kimutatták az M1/M2 ATM-ek szerepét az inzulinérzékenység szabályozásában. Az M1 marker gének, például a TNF-a (15) és a C-C motívum kemokinreceptor (CCR) 2 (8) törlése vagy a CD11c-pozitív sejtek ablációja az inzulinérzékenység normalizálódását eredményezte (16). Másrészt azok az egerek, amelyek peroxiszóma proliferátor-aktivált receptor (PPAR) γ vagy PPARβ/δ makrofágspecifikus kiütéssel rendelkeznek, csökkent M2-makrofágok számával és károsodott funkcióval rendelkező inzulinrezisztenciát mutattak (17–20). Ez utóbbi vizsgálatok azt is jelezték, hogy az adipocitákból vagy hepatocitákból származó IL-4 vagy IL-13 elősegíti a PPARγ és a PPARβ/δ expresszióját monocitákban, ami az M2 makrofágok differenciálódását eredményezi. Bár általánosan elfogadott, hogy az M1 ATM-ek különféle proinflammatorikus citokinek szekréciójával indukálják az inzulinrezisztenciát, az M2 ATM-ek hozzájárulása az inzulinrezisztencia javulásához jelenleg nem ismert.

Nemrégiben Lumeng et al. (10) a CD11c-t M1 markerként használta az áramlási citometriás elemzésben, és beszámolt arról, hogy a magas zsírtartalmú étrend (HFD) által kiváltott elhízás elmozdulást okoz az ATM-ekben a sovány állatok M2 polarizált állapotából az M1 proinflammatorikus állapotba. Azonban a diéta által kiváltott elhízott egerekben az M1 makrofágok megnövekedett arányának indukciójának pontos mechanizmusa nem teljesen ismert (pl. Keringő monocitákból újonnan toborzott M1 makrofágok, vagy a sovány zsírszövetben jelen lévő M2 makrofágok differenciálódnak-e M1 makrofágokká ?)

Az M1 és M2 markerek számának, valamint génexpressziójának változásainak pontosabb értékeléséhez áramlási citometriával elemeztük az egér ATM-eket, a CD206-ot M2-markerként, a CD11c M1-markerként történő felhasználása mellett. Itt megmutatjuk, hogy a CD11c-pozitív/CD206-negatív M1 ATM-ek és a CD206-pozitív/CD11c-negatív M2 ATM-ek különálló populációt alkottak. Az M1 makrofágok száma és az M1/M2 arány az inzulinrezisztencia kialakulásához kapcsolódik. Érdekes módon az IL-10 adenovírus vektor általi túlzott expressziója megnövelte az M2 ATM-ek markereit a zsírszövetben, ami arra utal, hogy a HFD és/vagy pioglitazone kezelés által fokozott IL-10 expresszió szerepet játszhat az ATM-ek fenotípusos kapcsolásában.

KUTATÁSI TERVEZÉS ÉS MÓDSZEREK

A pioglitazont Takeda (Tokió, Japán) készítette. Patkány monoklonális antitestet egér F4/80 ellen, patkány monoklonális antitestet egér CD11c ellen, patkány CD206 antitestet konjugált Alexa 647-gyel és patkány MglI antitestet konjugált Alexa 488-mal az AbD-Serotec-től (Oxford, Egyesült Királyság). Fluoreszcein-izotiocianáttal konjugált patkány F4/80 antitestet és fikoeritrinnel konjugált hörcsög CD11c antitestet vásároltak az eBiosciences-től (San Diego, Kalifornia), illetve a BD Biosciences-től (San Jose, Kalifornia).

Egerek karbantartása.

Hat hetes C57BL/6J hím egereket a CLEA Japan-tól (Meguro-Ku, Japán) vásároltak. Az egereket standard fényciklus alatt tartottuk (12 óra világos/sötét), és szabad hozzáférést biztosítottak hozzájuk a vízhez és az élelemhez. 10 hét zsírtartalmú szokásos étrendet (Nosan Corporation, Yokohama, Japán) vagy 60% zsírtartalmú HFD-t (Research Diets, New Brunswick, NJ) tápláltak 17 hétig. A diétás beavatkozás utolsó 5 hetében a HFD-t kapó egerek felét pioglitazonnal (10 mg · kg –1 · nap –1) kiegészített HFD-re váltották. A kísérletek állatgondozási politikáját és eljárásait a Toyamai Egyetem állatkísérleti bizottsága hagyta jóvá.

Adenovírus-vektor fertőzése.

A humán IL-10-et kódoló cDNS-t egy adenovírus vektorba inszertáltuk az Adenovirus Expression Vector Kit (Ad-hIL-10) (Takara Bio, Shiga, Japán) alkalmazásával, a korábban leírtak szerint (21). Ad-X-DsRed2 (Ad-R2), a Discosoma sp. vörös fluoreszcens fehérjét használtunk kontroll vektorként (Clontech, Mountain View, CA). Az Ad-hIL-10-et vagy az Ad-R2-t intraperitoneálisan injektáltuk.

Makrofágok immunhisztokémiája fehér zsírszövetekben.

Az F4/80 festést aminosav polimer detektáló rendszer és Histofine Mouse Stain Kit (Nichirei, Tokió, Japán) alkalmazásával végeztük. A metszeteket anti-F4/80 antitesttel (hígítás, 1: 100) inkubáltuk egy éjszakán át 4 ° C-on, és 30 percen át inkubáltuk egy Histofine Simple Stain Max PO (patkány) szekunder antitesttel. A CD11c festéshez a metszeteket hörcsög anti-egér CD11c antitestekkel (hígítás, 1:20) inkubáltuk 3 órán át, majd kecske anti-hörcsög IgG antitesttel (hígítás, 1: 100) 1 órán át, végül pedig Histofine Simple-vel. Stain Max PO (kecske) 30 percig. Negatív kontroll vizsgálatokat is végeztek ezen első antitestek használata nélkül. Az összes metszetet hematoxilinnel ellenfestettük. A sejtek és koronaszerű struktúrák teljes számát 10 különböző nagy teljesítményű mezőben számoltuk meg minden szakaszból.

Adipociták és stroma-vaszkuláris frakciók izolálása.

Az egerek epididimális zsírszöveteit sóoldattal öblítettük, finom darabokra aprítottuk, és kollagenázzal (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) emésztettük Krebs-Henseleit-HEPES pufferrel (pH = 7,4), 20 mg/ml BSA-val kiegészítve. 2 mmol/l glükóz 37 ° C-on rázógép alkalmazásával 45 percig. Ezután a mintákat hálón átengedtük és rövid centrifugálással (1000 fordulat/perc) frakcionáltuk. A pelleteket vagy az úszó sejteket sztróma-vaszkuláris frakcióként (SVF) vagy adipocita frakcióként gyűjtöttük össze. Az egyes frakciókban lévő sejteket használtuk RNS extrakcióhoz vagy áramlási citometriás elemzéshez.

Áramlási citometriás elemzés.

Az SVF-ben lévő sejteket 15 percig, 4 ° C-on Pharm Lyse-ben (BD Biosciences) inkubáltuk, majd Pharmingen festékpufferben (BD Biosciences) újraszuszpendáltuk. A sejteket 2,4G2-vel (BD Biosciences) inkubáltuk 10 percig, majd primer antitestekkel vagy a megfelelő kontroll izotípusokkal 30 percig 4 ° C-on. Ezután a sejteket kétszer öblítettük és Pharmingen festékpufferben szuszpendáltuk. 7-amino-aktinomicin D-vel (BD Biosciences) történő inkubálás után a sejteket FACSAria sejtrendezővel (BD Biosciences) elemeztük. Az adatok elemzését a FlowJo (Tree Star, Ashland, OR) segítségével végeztük. Az M1 vagy M2 makrofágokat F4/80-pozitív/CD11c-pozitív/CD206-negatív vagy F4/80-pozitív/CD11c-negatív/CD206-pozitív sejtként azonosítottuk. Az M1 vagy M2 makrofágok számát úgy számítottuk, hogy a tripánkék - negatív sejtek számát megszoroztuk az F4/80-pozitív/CD11c-pozitív/CD206-negatív sejtek vagy az F4/80-pozitív/CD11c-negatív/CD206-pozitív sejtek.

Kvantitatív RT-PCR.

A teljes RNS-t extrahálták epididymális zsírszövetből vagy válogatott sejtekből az RNeasy kit (Qiagen, Hilden, Németország) segítségével. A cDNS-t többszörös szekvenciájú reverz transzkriptázzal szintetizáltuk (Applied Biosystems, Foster City, CA). Minden gén kvantitatív RT-PCR-jét TaqMan módszerrel hajtottuk végre (50 ° C 2 percig, 95 ° C 10 percig, és 40 ciklus 95 ° C hőmérsékleten 15 másodpercig és 60 ° C 1 percig) előre elkészített primer készletekkel (Applied Biosystems). Az átírások relatív bőségét a 18S mRNS expressziója szerint normalizáltuk, és standard görbe módszerrel elemeztük.