A hidegen sajtolt minke bálnaolaj csökkenti a keringő LDL/VLDL-koleszterinszintet, a lipidoxidációt és az aterogenezist az apolipoprotein E-hiányos egerekben, amelyek nyugati típusú étrendet adtak 13 hétig

Absztrakt

Háttér

A hosszú láncú n3-többszörösen telítetlen zsírsavak (LC n3-PUFA) jól ismertek gyulladáscsökkentő hatásukról és a szív- és érrendszeri betegségekre gyakorolt hatásukról. A hidegen sajtolt bálnaolaj (CWO) fele annyi LC n3-PUFA-t tartalmaz, mint a tőkemájolaj (CLO). Mégis, a humán intervenciós vizsgálatokban a CWO-bevitelnél kifejezettebb jótékony hatást figyeltek meg a szív- és érrendszeri betegségek markerein a CLO-bevitelhez képest. A CWO zsírsavaktól mentes kivonatairól szintén kiderült, hogy in vitro antioxidáns és gyulladásgátló hatást mutatnak. A tanulmány célja annak vizsgálata volt, hogy a CWO-val kiegészített magas zsírtartalmú Western típusú étrend (WD) bevitele megakadályozza-e az ateroszklerotikus elváltozások kialakulását az apolipoprotein E-hiányos (ApoE -/-) egerekben.

Mód

Hetven nőstény ApoE -/- egeret tápláltak 1% CWO-t, CLO-t vagy kukoricaolajat (CO) tartalmazó WD-vel. Kiértékelték az érelmeszesedéses elváltozások kialakulását, a test és a szövet súlyát, a máj génexpresszióját, valamint az LDL/VLDL-koleszterin, ox-LDL szérumszintjét, az összes antioxidáns státuszt és a különféle szérum kardiovaszkuláris betegség/gyulladáscsökkentő markerek értékeit. Statisztikai elemzéseket SPSS alkalmazásával, Shapiro-Wilk tesztjét pedig elvégeztük a változók eloszlásának meghatározására. A statisztikai különbséget egyutas ANOVA alkalmazásával értékeltük Tukeys post hoc tesztjével vagy Kruskal-Wallis teszttel. A máj relatív génexpresszióját a REST 2009 alkalmazásával elemeztük (V2.0.13).

Eredmények

A CWO-val táplált egereknek kevesebb atherosclerotikus elváltozása volt az aortaívben, mint a CO-val táplált egerekben. Az LDL/VLDL-koleszterin és az ox-LDL-koleszterin szintje szintén jelentősen csökkent, míg a COW-vel táplált egereknél az összes antioxidáns szint emelkedett. Ezen túlmenően a CWO-val táplált egerek kevesebb súlyt kaptak, és a koleszterin anyagcserében részt vevő számos májgén szabályozott volt a CO-val táplált egerekhez képest.

Következtetés

A jelen vizsgálatban 1% CWO-val kiegészített WD-vel táplált egereknél csökkent az ateroszklerotikus elváltozások képződése az aortaívben, csökkent a szérum LDL/VLDL-koleszterin és az ox-LDL-koleszterin szintje, emelkedett a szérum összes antioxidáns státusza és csökkent a testsúly az egerekhez képest 1% CO-val kiegészített WD-vel tápláltuk.

Háttér

Az érelmeszesedést az artériás lipid elváltozások jellemzik a nagy artériák intimájában, és a betegség évtizedekig halk vagy tünetmentes lehet. Az érelmeszesedés azonban számos más kardiovaszkuláris betegség (CVD), mint például az instabil angina, a szívinfarktus és a stroke fő oka. Az érfalban évekig tartó lipidfelhalmozódás okozza a lepedékképződést és a lumen szűkülését. A lepedékrepedés végül akut aterotrombózishoz vezethet, amely megakadályozza a tüdő, a szív és az agy szövetének megfelelő véráramlását [1, 2]. Az érelmeszesedés és a gyulladás közötti kapcsolatot átfogóan tisztázták [3,4,5,6,7], és számos citokin és kemokin kulcsszerepet játszik az érelmeszesedés progressziójában [8,9,10,11]. A hosszú láncú n3-többszörösen telítetlen zsírsavak (LC n3-PUFA) gyulladáscsökkentő hatásai jól ismertek. Különösen az eikozapentaénsav (EPA) és a dokozahexaénsav (DHA), és hogyan járulnak hozzá az érelmeszesedés progressziójának mérsékléséhez a szívkoszorúér betegeknél [12,13,14,15,16,17]. Az olajos hal jó táplálékforrás az EPA és a DHA számára. A hal más alkotórészeket is tartalmaz, például fehérjéket, aminosavakat, peptideket és bioaktív vegyületeket, amelyek hozzájárulhatnak a halbevitel után megfigyelt jótékony hatásokhoz [18,19,20].

A közönséges bálna (Balaenoptera acutorostrata) rákokkal és nyílt tengeri halakkal táplálkozik az Atlanti-óceán északi részén [21], és vastag habrétegük létfontosságú a hőszigetelés, a felhajtóerő és az energiatárolás szempontjából [22]. A habarcs évszázadok óta fontos része az északi-sarkvidéki és szubarktiszi őslakosok étrendjének. Két évtizeddel ezelőtt egy nagyobb vizsgálat keretében hidegen sajtolt bálnaolajat (CWO) és tőkemájolajat (CLO) adtak étrend-kiegészítőként egészséges egyéneknek [23, 24]. Az eredmények azt mutatták, hogy a CWO csoport jótékony hatással volt a CVD markerekre és javította a gyulladásos hatást, a CLO csoporthoz képest is. A CWO és a CLO zsírsav- (FA) összetétele az LC n3-PUFA mennyiségében különbözik. A bálnafehérje 10,3% LC n3-PUFA-t tartalmaz, beleértve 3,3% EPA-t, 1,7% dokozapentaénsavat (DPA) és 4,7% DHA-t, míg a CLO-ban 25,1% LC n3-PUFA van, beleértve 9,5% EPA-t, 1% DPA-t és 13,5% DHA-t CLO-ban [24]. A közelmúltban egy zsírsavaktól mentes CWO-val végzett in vitro vizsgálat során kimutattuk, hogy a CWO extrahálható antioxidánsokat tartalmaz, és gyulladáscsökkentő hatással rendelkezik az eddig nem azonosított vegyületekkel [25].

Jelen tanulmányban azt vizsgáltuk, hogy a magas zsírtartalmú nyugati típusú étrend (WD), amelyet CWO vagy finomított bálnaolaj (RWO) egészít ki, kombinálva a bálnafehérje kivonataival, megakadályozza-e az ateroszklerotikus elváltozások kialakulását Apolipoprotein E-hiányban (ApoE -/-) egerek.

Mód

Kísérleti állatok és tartás

Hetvenkét kórokozótól mentes nőstény ApoE -/- -egér (B6.129P2-Apoe tm1 Unc N11) a Taconic-tól (Taconic M&B, Ry, Dánia) szereztük be. A helyi állattartó létesítménybe való megérkezés után az összes egeret kijelöltük és véletlenszerűen 6 csoportba osztottuk (n = 12) beavatkozásonként azonos számú ketrecgel (n = 4 ketrec/diéta). Az egy hetes akklimatizáció során bekövetkezett fogyás miatt két egeret kizártunk (n = 11 az RWO-I és CWO csoportokban). A kísérlet kezdetén az egerek 6 hetesek voltak, testtömegük 16 és 21 g között volt. A vízzel és pelletált takarmánnyal ellátott egereket 13 héten át szellőztetett ketrecekben tartottuk, ugyanabban a helyiségben, egy hagyományos laboratóriumi állategységben. A hőmérséklet és a relatív páratartalom 21 ° C és 55% volt egy 12 napos/éjszakai ciklusban (fény: 0600-1800 óra). A ketreceket és az ágyneműt hetente egyszer cserélték. A vizsgálat végén az összes egeret 3 órán át táplálék nélkül hagyták, mielőtt széndioxid inhalációval eutanizálták volna. A vért szívszúrással vettük, a szérumot elkészítettük és -80 ° C-on lefagyasztottuk. A szív-, a máj-, a vese-, a lép- és a zsírszöveteket kivágtuk, lemértük, lefagyasztottuk és -80 ° C-on tároltuk.

Diétás olajok készítése

A közönséges jércebálna frissen fagyasztott kenőcsét az Ellingsen Seafood AS (Skrova, Norvégia) biztosította. Az edényt az 1. táblázatban szereplő centrifugálás előtt egyszer ledaráltuk. Az étrend tartalma g/kg

Az ateroszklerotikus plakk elemzése

Közvetlenül a vérelvezetés után az összes egeret perfundáltuk a bal kamrán steril sóoldattal (0,9%), amíg a perfuzátumban nem látszott maradék vér (kb. 5 perc perfúzió). A teljes aortát (az aortától a csípő artériák bifurkációjáig felfelé haladó proximális) in situ megtisztítottuk a periadventiális zsírtól, feldaraboltuk és 1% paraformaldehid oldatban rögzítettük. Végül az aortát olajvörös O festéssel festették, hosszanti irányban kinyitották és személyesen-diákra szerelve a korábban leírtak szerint [27]. 48 órás pihenés után a tárgylemezeket nagy felbontású szkennerrel szkenneltük be. Az elváltozások területeit ImageJ szoftverrel értékelték [28], és az érelmeszesedés mértékét az adott aorta vagy egy aorta régió teljes területének százalékában adták meg, amelyet az ateroszklerotikus elváltozások foglaltak el.

Teljes RNS extrakció

Az egerek perfúziója után a májat eltávolítottuk, lemértük és folyékony nitrogénben lefagyasztottuk, mielőtt az extrakcióig -80 ° C-on tároltuk. Száz mg májszövetet homogenizáltunk 1 ml Trizol-ban (Life Technologies) gyöngyőrléssel (Precellys 24, Bertin Technologies). A mintákat jégen inkubáltuk 30 percig, majd 20 percig centrifugáltuk 12000 x g-vel 4 ° C-on. A mintákat egy éjszakán át izopropanollal kicsaptuk, és 21 000 × g értéket 30 percig 4 ° C-on centrifugáltuk. A pelleteket RNS-tároló oldatokban oldjuk, és az RNS-t további feldolgozásig -80 ° C-on tároljuk. A teljes RNS-koncentrációt Qubit 1.0 fluorométerrel (Life Technologies) és az Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Inc.) tesztelt minőségével mértük. A felhasznált minták RNS-integritási tényezője 7,6–9,3 volt.

Fordított transzkripció és kvantitatív valós idejű PCR

Nagy kapacitású cDNS reverz transzkripciós készletet (4 368 813, Applied Biosystems) használtunk 3 reverz transzkriptáz triplikátum előállítására (50 ng teljes RNS 20 μl-ben). Kvantitatív RT-PCR-t használtunk 4 μl cDNS elemzésére 20 μl reakcióban TaqMan® Fast Universal PCR Master mix (4 352 042, Applied Biosystems) és előre megtervezett TaqMan® Gene Expression vizsgálatokkal (1. kiegészítő fájl: S1. Táblázat). A 96 lyukú lemezeket az ABI Prism 7500 Fast cycler (Applied Biosystems) berendezésen futtattuk az előre beállított amplifikációs profil alkalmazásával (95 ° C 20s, 40x95 ° C3s és 60 ° C30s). A legstabilabban expresszált endogén referenciagének, a hipoxantin-guanin-foszforibozil-transzferáz 1 (Hprt1) és a TATA-Box kötő fehérje (Tbp), a TaqMan Array egér endogén kontroll vizsgálattal (4 426 701, Applied Biosystems) választottuk ki. Ezen referencia gének geometriai átlagát használtuk a génexpresszió normalizálására. Minden vizsgálatba lemezközi kalibrátort és sablon nélküli kontrollokat vontunk be.

Szérumelemzések

Szérum koleszterin, alacsony sűrűségű lipoprotein koleszterin és nagyon alacsony sűrűségű lipoprotein (LDL/VLDL), glükóz, triacil-glicerin (TAG), összes fehérjekoncentráció, húgysav, nem észterezett zsírsavak (NEFA; D07940, Dialab, Ausztria) és összesen antioxidáns státuszt (TAS; NX2332 Randox Total Antioxidant Status, Randox Laboratories Ltd., Egyesült Királyság) hagyományos enzimes készletekkel és egy MaxMat PLII bioanalizátorral (MaxMat PL, Montpellier, Franciaország) elemeztük. Eltérő rendelkezés hiányában az összes készlet a MaxMat PL-től (Montpellier, Franciaország) származik. A szérumban oxidált LDL-t (Ox-LDL) két példányban számítottuk ki a gyártók utasításai szerint, egér ELISA készlettel (E90527Mu, USCN Life Science Inc., Texas, USA). A szérummintákat két példányban elemeztük a következő citokinek tekintetében: gamma-interferon (IFNγ), interleukin 10 (IL-10), interleukin 1 béta (IL-1β), interleukin 2 (IL-2), interleukin 5 (IL-5), interleukin 6 (IL-6), a keratinocita kemoattraktáns növekedéssel szabályozott onkogén (KC-GRO) és a tumor nekrózis faktor alfa (TNF-a). Ezeket az elemzéseket a gyártók utasításai szerint hajtottuk végre, az MSD egér gyulladásos panel 1 V-Plex készlet használatával (MULTI-ARRAY®, Meso Scale Discovery, Gaithersburg, MD).

Statisztikai elemzések

Az összes statisztikai elemzést az IBM SPSS Statistics for Macintosh (22.0.0.0 kiadás, SPSS, Inc., Chicago, IL, USA) alkalmazásával hajtottuk végre. A változók eloszlásának meghatározására a Shapiro-Wilk tesztet végeztük, és a nem normálisan elosztott változókat log-transzformáltuk statisztikai elemzés előtt. A statisztikai különbséget egyutas ANOVA alkalmazásával értékeltük Tukeys post hoc tesztjével vagy Kruskal-Wallis teszttel. A relatív génexpressziót a REST 2009 (V2.0.13) alkalmazásával elemeztük [29]. Értéke o

Eredmények

Az általános fizikai egészségi állapot és a súlygyarapodás normálnak tűnt minden egér esetében, kivéve egy CO-val táplált egeret (súlycsökkenés miatt eutanizálták) a kísérleti étrenddel folytatott 13 hét alatt. Az átlagos napi takarmányfelvétel (g/egér) megegyezett a 6 diétás csoportban (1. ábra). Ennek ellenére a CWO-val táplált egerek kevesebb testtömeget nyertek, mint a CO-val táplált egerek (2a. Ábra). A CWO-val és az RWO-II-vel táplált egerek májsúlya alacsonyabb volt, mint a CO-vel táplált egerek máj-súlya (2b. Ábra). Ezek a szignifikáns különbségek a relatív májtömegben is fennálltak. A fehér zsírszövet mennyisége szintén alacsonyabb volt a CWO-val táplált egerekben a CO-val etetett egerekhez képest (1,44 g ± 0,12 vs 2,24 ± 0,2), azonban nem szignifikánso = 0,078). Nem voltak nyilvánvaló különbségek a szövetméretekben a szív, a vese vagy a lép csoportjai között (2. táblázat). Az összes kísérleti étrend növekedési görbéjét az 1. és 2. ábra szemlélteti. 2c.

A női apolipoprotein E-hiányos egerek átlagos napi takarmányfelvétele (g/egér) 13 héten át zsírtartalmú étrendet fogyasztottak, különböző olajokkal kiegészítve. Az eredményeket átlag ± SD-ként mutatjuk be. CO (n = 11), CLOn = 12), RWOn = 12), RWO-In = 11), RWO-IIn = 12), CWOn = 11)

Ateroszklerotikus elváltozások

Öt egeret távolítottunk el az adathalmazból az érelmeszesedéses elváltozások elemzéséhez módszertani műtárgyak vagy a hasi aorta súlyos meszesedése (a veseartériáktól a csípő kétágúságáig) miatt, annak ellenére, hogy az aortaív régiójában minimális lézió képződött. A kihagyott egerek voltak; három CLO-val etetett egér (n = 9), egy egér táplálta az RWO-tn = 11) és egy egérrel táplált CWO-tn = 10). A CWO-val táplált egereknél az aortaívben található elváltozás területe alacsonyabb volt, mint a CO-vel táplált egerekben az aortaív elváltozásának területe (3a. Ábra). Nem figyeltünk meg szignifikáns különbséget a csoportok között az aorta más régióiban (hasi rész, mellkasi rész vagy akár a teljes aorta esetében) (3b-d. Ábra).

Szérum antioxidáns státusz, szérum LDL/VLDL-koleszterinszint és szérum ox-LDL szint

A szérum TAS magasabb volt a CWO-val és RWO-II-vel etetett egerekben, mint a CO-val táplált egerekben (4a. Ábra). Az RWO-I, RWO-II és CWO táplált egerekben a TAS is magasabb volt, mint a CLO-val táplált egerekben a TAS (4a. Ábra). A szérum LDL/VLDL-koleszterinszint és a szérum ox-LDL-koleszterinszint alacsonyabb volt az RWO-I-vel, RWO-II-vel és CWO-val etetett egerekben ezekhez a szintekhez képest CO-val táplált egerekben (4b. És c. Ábra). Az összes koleszterin (4d. Ábra) és a szérum trigliceridek nem különböztek a CO-val etetett egerek és a többi étrendcsoport között; sem a szérum glükóz-, sem a citokinszintek (2. táblázat).

Gén expresszió

Vita

A tanulmány fő célja annak vizsgálata volt, hogy a CWO-val kiegészített WD (F diéta) étrendi fogyasztása megakadályozza-e az érelmeszesedést az ApoE -/- egerekben. Nemrégiben csoportunk kimutatta, hogy a CWO kivonatai antioxidáns és gyulladáscsökkentő aktivitással rendelkeznek, amelyek nem kapcsolódnak a jelen lévő LC n3-PUFA tartalmához [25]. Amikor a CWO-t étrend-kiegészítőként adták egészséges önkénteseknek, jótékony hatást figyeltek meg a CVD markerekre és javult a gyulladáscsökkentő hatás [23, 24]. A WD-t 1% CWO-val vagy 1% RWO-val egészítették ki, két különféle bálnafoltos kivonattal dúsítva, a korábbi eredmények alapján CO (A diéta) és CLO (B diéta) kontroll étrendként [23,24,25].

A bálnafehérjében a halolajokhoz képest alacsonyabb EPA- és DHA-tartalom miatt változatlan szérum TAG-szintet vártunk és figyeltünk meg. Változatlan szérum TAG-szinteket figyeltek meg számos más vizsgálatban, ahol az ApoE -/- egereknek összehasonlítható mennyiségű EPA-t, DPA-t és DHA-t kaptak [38,39,40]. A szérum TAG-szintek hatékony csökkentéséhez EPA, DPA és DHA kiegészítésre van szükség gyógyszerészeti dózisokban, amelyeket nehéz diétával elérni [41]. A bálnafehérjeolajról ismert, hogy a halolajhoz képest nagy mennyiségben tartalmaz DPA-t, és egyes tanulmányok szerint a DPA lehet a legfontosabb LC n3-PUFA a CVD elleni védelem tekintetében [42, 43]. Ezek az eredmények együttvéve azt jelenthetik, hogy az étrendi CWO elősegíti a koleszterin kiürülését a keringésből, a koleszterin fokozott kiürülését a májban, megemeli a TAS-szintet, csökkenti az LDL-koleszterin oxidációját, mindez az ateroszklerózis enyhítésére szolgál.

Következtetés

Jelen tanulmányban azt figyeltük meg, hogy az 1% CWO-val WD-vel táplált egerek csökkentették az ateroszklerotikus elváltozások képződését az aortaívben, összehasonlítva az 1% CO-t tartalmazó WD-vel táplált egerekkel. Ezenkívül a CWO-val táplált egereknek csökkent a szérum LDL/VLDL-koleszterin, ox-LDL-koleszterin és testtömegük, és megnőtt a szérum összes antioxidáns státusa a CO-val táplált egerekhez képest. Vizsgálatunk új betekintést nyújt az étrendi CWO-kiegészítés feltételezett védelmi mechanizmusaiba a CVD-ben, beleértve az endogén antioxidáns válaszok aktiválását, az LDL oxidáció gátlását, a diéta által kiváltott hiperkoleszterinémia csillapítását és az aorta aterogenezisének csökkentését. Ezek az eredmények felhasználhatják a jövőbeni étrendi ajánlásokat a CVD csökkentése és a közegészség előmozdítása érdekében.

Rövidítések

ATP kötőkazetta, G alcsalád 5. tagja

ATP kötőkazetta, G alcsalád 8. tagja