Bél- és idegsejtek myenterikus adaptációi a vékonybélben, amelyet egerek zsírtartalmú étrendje vált ki

Angelica Soares

1 Orvosi és Gyógyszerésztudományi Központ, Paranától nyugatra fekvő Állami Egyetem, R. Universitária, 1619, Cascavel, PR CEP 85819-110 Brazília

Evandro José Beraldi

2 Morfológiai Tudományok Tanszék, Maringá Állami Egyetem, Av. Colombo, 5790, Maringá, PR CEP 87020-900, Brazília

Paulo Emílio Botura Ferreira

2 Morfológiai Tudományok Tanszék, Maringá Állami Egyetem, Av. Colombo, 5790, Maringá, PR CEP 87020-900, Brazília

Roberto Barbosa Bazotte

3 Farmakológiai és Terápiás Tanszék, Maringá Állami Egyetem, Av. Colombo, 5790, Maringá, PR CEP 87020-900, Brazília

Nilza Cristina Buttow

2 Morfológiai Tudományok Tanszék, Maringá Állami Egyetem, Av. Colombo, 5790, Maringá, PR CEP 87020-900, Brazília

Absztrakt

Háttér

Az elhízás elterjedtsége riasztó mértékben nőtt, különösen a magas zsírtartalmú étrend (HFD) fokozott fogyasztása miatt. A HFD-k intrinsic beidegződésre és a bélfalra gyakorolt hatását még nem írták le teljes mértékben. Ennek a vizsgálatnak a célja a myenterialis neuronok és a vékonybél falának morfokvantitatív aspektusainak vizsgálata volt HFD-vel táplált egerekben.

Mód

A svájci egereket HFD-vel (59% kcal zsírból) vagy szokásos chow-val (9% Kcal zsírból) etették 8 héten keresztül. A duodenum, a jejunum és az ileum szegmenseit szövettani feldolgozásnak vetettük alá a bélfal és a nyálkahártya sejtek morfokvantitatív vizsgálatához, és immunhisztokémiát végeztünk a myenterialis neuronok értékelésére. Az egyes szegmensek adatait összehasonlítottuk a csoportok között egy párosítatlan Student-féle t-teszttel vagy ezzel egyenértékű, nem paraméteres teszttel.

Eredmények

A HFD növelte a testsúlyt és a zsigeri zsírt, valamint csökkentette a vékonybél hosszát és az ileum kerületét. A duodenumban a HFD növelte a nitrergikus részpopuláció sűrűségét, és csökkentette a nitrerg neuronok és a vazoaktív bélpeptid (VIP) varikozitások területét. A jejunumban a nitrergikus szubpopuláció sűrűsége nőtt, az általános populáció idegterületei, a nitrergikus szubpopuláció és a (VIP) varikozitások csökkentek. Az ileumban az általános populáció sűrűsége és a nitrergikus szubpopuláció növekedett, az általános populáció idegterületei, a nitrergikus szubpopuláció és a (VIP) varikozitások csökkentek. A bolyhok, kripták, izomréteg és a teljes fal morfometriai paraméterei általában növekedtek a duodenumban és a jejunumban, és csökkentek az ileumban. A duodenumban és a jejunumban a HFD elősegítette az intraepithelialis limfociták arányának csökkenését. Az ileumban csökkent az intraepithelialis limfociták és a serlegsejtek aránya, és az enteroendokrin sejtek növekedtek.

Következtetések

A magas zsírtartalmú étrend megváltoztatja a vékonybél, a bélfal és a nyálkahártya sejtek myenterikus beidegződését, amelyek felelősek a hormonok szekréciójáért és a bél védő gátjának fenntartásáért. A morfokvantitatív adatok további vizsgálatok alapját képezik, amelyek tisztázzák a HFD mozgékonyságában, emésztési és felszívóképességében, valamint a bélgáton gyakorolt hatását.

Háttér

Az elhízás kihívást jelent a globális közegészségügy számára, különös tekintettel a krónikus betegségek, például a cukorbetegség, a magas vérnyomás, a szív- és érrendszeri betegségek és a rák összefüggésére [1]. A globális adatok szerint a felnőtt nők 14% -a és a felnőtt férfiak 10% -a elhízott [1]. Az elhízás növekvő aránya tükrözi a modern társadalom viselkedésbeli változásait, beleértve a zsírban gazdag és nagy energiasűrűségű ételek nagyobb mennyiségű bevitelét is [2].

A magas zsírtartalmú étrend (HFD) fogyasztása, amelyet általában 20-60% zsírtartalommal állítanak elő [3], az emberek [2] és az állatok [3-5] elhízásának kialakulásával jár. Állatokban a HFD-k hasonló rendellenességeket váltanak ki, mint amelyek az emberi elhízásnál fordulnak elő, például hiperglikémiát [4], inzulinrezisztenciát és 2-es típusú cukorbetegséget [5].

Néhány tanulmány beszámolt a HFD hatásáról a gyomor-bél traktusra. A válaszok azonban eltérőek, ha összehasonlítjuk a telített zsírok különböző forrásait (68:28 telített: egyszeresen telítetlen zsír vs. 39:45 telített: egyszeresen telítetlen zsír) [6,7], és ha ezeket összehasonlítjuk a magas egyszeresen telítetlen zsírokkal (12:80) telített: egyszeresen telítetlen zsír) [6]. Például a bélnyálkahártyában a telített zsír (39:45 telített: egyszeresen telítetlen) megnövelte a bél magasságát a jejunumban és az ileumban csak 3 nap múlva a bél reszekción átesett állatoknál [7], míg a magas telített zsír (68:28 telített: egyszeresen telítetlen) 8,4 hétig csökkentette a villus magasságát ugyanezekben a szegmensekben [6]. A zsír befolyásolja a váladék szekrécióját, a serlegsejtek számát [8] és a sejtek szaporodását is [7,8]. Ezek a változások befolyásolhatják a tápanyagok felszívódását és a nyálkahártya gátjának védő funkcióját. A bélhám sejtpopulációit tekintve az intraepithelialis limfociták és a főként serlegsejtek által termelt nyálka gát kapcsolódik az immunvédelemhez, és a HFD hatással lehet rájuk [9].

Az enteroendokrin sejtek egy másik sejtpopuláció, amely kapcsolatban áll a tápanyagok felszívódásával, és amelyek emésztőrendszeri hormonokat választanak ki, amelyek integrált módon működnek az emésztés és a felszívódás optimalizálása érdekében [10]. Továbbá a bizonyítékok azt mutatják, hogy ezek a sejtek kölcsönhatásba lépnek az idegrendszerrel, aktiválhatják a helyi idegi áramköröket, és elősegíthetik a motoros, szekréciós és értágító tevékenységet [11].

Korábbi tanulmányok beszámoltak a zsírnak a gyomor-bélrendszeri mozgékonyságra gyakorolt hatásáról [12,13]. Ezeknek az elváltozásoknak a patogenezise megváltoztathatja az enterikus idegrendszer által képviselt belső beidegződést. A legfrissebb vizsgálatok a myenterialis neuropathiát írták le HFD-fogyasztás után [5,14]. A mienterikus neuronok eltérően érintettek, és különösen érzékenyek a neuronok nitrogén-oxid-szintázát (nNOS) és vazoaktív bélpeptidjét (VIP) expresszáló neuronok szubpopulációi [5]. Ezen intim kapcsolat miatt a myentericus neuroplasticitás az izmos tunika és a bélfal szerkezeti változásaival járhat, amire az irodalom is utal [15,16].

Jelen tanulmány a HFD általános neuronpopulációra (miozin-V-immunreaktív [IR]) és nitrergikus (nNOS-IR) és VIP-ergikus (VIP-IR) szubpopulációira gyakorolt hatásait értékelte a vékonybél myenterikus plexusában. egerek. Ezenkívül tanulmányozták a bélfal morfológiáját, a sejtproliferációt és a serlegsejtek, az enteroendokrin sejtek és az intraepithelialis limfociták szubpopulációit.

Mód

Állatok és vizsgálati csoportok

Hím svájci egereket (Mus musculus) a Maringá Állami Egyetem Központi Bioteriumából nyertek. Az állatokat kontrollált szobahőmérsékleten (22 ± 2 ° C) és 12/12 órás világos/sötét ciklusban tartottuk, és külön ketrecekben helyeztük el őket. Az összes eljárást a Maringá Állami Egyetem állatkísérletekkel foglalkozó etikai bizottsága hagyta jóvá, és az állatjólétre vonatkozó nemzetközi törvényeket követte.

42 napos korban az állatok súlya átlagosan 34 g volt, két csoportba osztva, egyenként 10 állattal: kontrollállatok (CON csoport), amelyeket standard rágcsáló-chow-val (9% kcal zsírból) etettek (Nuvilab, Quimtia SA, Colombo, PR, Brazília) és azok a kísérleti állatok, amelyeket 59% kcal zsírtartalmú HFD-vel etettek 8 héten keresztül (OB csoport). A HFD-t (1. táblázat) disznózsír felhasználásával állítottuk elő, olyan összetételben, amely pontosan megegyezett az Arçari et al. [4] és az AIN-93G tisztított étrend alapján [17]. A zsírnak kb. 40:40 telített: egyszeresen telítetlen zsír van, és gazdag palmitinsavban, hosszú láncú trigliceridben. A zsírsavak mennyisége a standard chow-ban a teljes tömeg 4% -a volt; a HFD-ben 35% volt. Mindkét csoport számára ad libitum hozzáférést biztosítottak az élelemhez és a vízhez.

Asztal 1

A standard chow és a magas zsírtartalmú étrend (HFD) tápanyag-összetétele

Alapértelmezett chowHFDg/100 g

Fehérje	22.	20
Szénhidrát	55	35
Összes zsíradék	4	35
Rost	7	5.
Mikroelemek	12.	5.
kcal/kg	3773	5358

Bélgyűjtés

15 órán át tartó éhomi étrend után az állatok 0,5 mg/kg vinkrisztin-szulfát oldatot kaptak 2 órával az eutanázia előtt (Tecnocris, Eurofarma, São Paulo, SP, Brazília) intraperitoneálisan, hogy blokkolják a bél hámjában lévő mitózist. Az állatokat lemértük és intraperitoneálisan altattuk 80 mg/kg Thiopentallal (Abbott Laboratories, Chicago, IL, USA), és laparotómián mentek keresztül a vékonybél és a periepididymális, retroperitoneális és mesenterialis zsírlerakódások összegyűjtésére. Megmértük a zsírlerakódásokat, és megmértük a vékonybél hosszát (a pyloritól az ileo-cecalis elágazásig). A duodenum, a jejunum és az ileum mintáit a begyűjtés után azonnal megnyitjuk a mesenterialis határon, és megmérjük a bél kerületét. A csoport 10 állatából öt immunhisztokémiai, a másik öt szövettani eljáráson ment keresztül.

Immunhisztokémiai technikák

A duodenum, a jejunum és az ileum mintáit foszfáttal pufferolt sóoldattal (PBS; 0,1 M, pH 7,4) mostuk, mindkét végén megkötöttük, feltöltöttük és 4% pufferolt paraformaldehiddel (pH 7,4) 2 órán át desztilláltuk. Rögzítés után a mintákat a mesenterialis határon kinyitottuk, PBS-sel mostuk és sztereomikroszkóp alatt mikrodisszekciót végeztünk. A nyálkahártyát és a submucosa tunikákat eltávolítottuk, és az izomréteget megtartottuk, hogy a myentericus plexust tartalmazó izmos tunika teljes egészét megszerezzük.

Az egész egységeket immunhisztokémiai technikáknak vetettük alá a miozin-V-IR myenterikus neuronok általános populációjának, az nNOS-IR myenterikus neuronok szubpopulációjának és a VIP-IR myentericus neuronok idegrostjainak varikozitásának megfigyelésére a körizomban.

Az egész egységeket kétszer PBS-ben mossuk 0,5% Triton-X100-mal (PBS-T), és blokkoló oldatban inkubáljuk, amely PBS-T-t, 2% szarvasmarha-szérumalbumint (BSA) és 10% nem immunos kecskeszérumot tartalmaz. 1 óra szobahőmérsékleten. Blokkolás után a teljes egységeket anti-miozin-V [18], anti-nNOS vagy anti-VIP primer antitesttel (2. táblázat) inkubáltuk PBS-T inkubációs oldatában, amely 2% BSA-t és 2% kecskét tartalmazott. szérum 48 órán át szobahőmérsékleten rázással. A teljes szerelvényeket háromszor PBS-T-ben mostuk, és 2 órán át szobahőmérsékleten inkubáltuk inkubációs oldatban, amely rázással a másodlagos antitestet tartalmazta (2. táblázat). Ezután háromszor mostuk PBS-T-ben, és üveglemezekre helyeztük 10% PBS glicerinnel.

2. táblázat

A miozin-V, nNOS és VIP immunreakcióiban alkalmazott primer és szekunder antitestek

AntibodyHostDilutionCompany

Miozin-V (elsődleges)	Nyúl	1: 200	Buttow és mtsai. [18]
nNOS (elsődleges)	Nyúl	1: 500	Zymed
VIP (elsődleges)	Nyúl	1: 500	Peninsula Laboratories, Inc.
Anti-nyúl IgG FITC (másodlagos)	Nyúl	1: 500	Santa Cruz biotechnológia

Az immunreaktív myenterikus neuronok mennyiségi és morfometriai elemzése

Az elemzéseket AxioCam MRC nagyfelbontású kamerával (Carl Zeiss, Jena, Németország) és Axioshop Plus fluoreszcens mikroszkóppal (Carl Zeiss, Jena, Németország) 200 × (miozin-V-IR és nNOS- IR neuronok) és 400x (VIP-IR varicositások) nagyítás. A képeket az Axio Vision Rel szoftver (4.6 v.) Segítségével számítógépre vitték, és az Image Pro Plus szoftverrel (4.5. Verzió, Media Cybernetics, Silver Spring, MD, USA) elemezték.

A képeket véletlenszerű mintavétel útján rögzítettük a szövettani tárgylemezeken lévő összes szerelvényen, nem választva konkrét vizuális mezőket, és ugyanazt a mezőt nem rögzítették többször. Az állatokonként 30 képen jelen lévő immunreaktív neuronokat (miozin-V-IR és nNOS-IR) minden szegmenshez megszámoltuk. Az egyes képek területe megközelítőleg 0,36 mm2, a teljes mennyiségileg meghatározott terület pedig 10,93 mm2 volt. Az eredményeket neuronok/cm 2 -ben fejezzük ki .

Állatonként 100 neuronális sejttest (miozin-V-IR és nNOS-IR) területeit mértük minden szegmensre, csoportonként mindegyik szegmensben összesen 500 neuronra. Méréseket olyan idegsejtekben végeztek, ahol egyértelműen meg lehetett látni a sejttest határait. Minden állat esetében 400 varikozitás területét mértük meg a körkörös izomban (VIP-IR) minden szegmensben állatonként, csoportonként összesen 2000-et; Az átfedő varicositásokat nem mértük. Az eredményeket μm 2 -ben fejezzük ki .

A bélfal morfometriai elemzése

A duodenum, a jejunum és az ileum mintáit megnyitottuk a mesenterialis határon, sóoldattal mostuk, Bouin oldatában 6 órán át rögzítettük, alkoholban dehidratáltuk, xilolban diafanizáltuk és paraffinba ágyazottuk. A félsoros hosszmetszeteket (28 μm intervallumokkal, 4 μm vastagsággal) hematoxilin-eozin (HE) festésnek vetettük alá.

A villus magasságának, kriptamélységének, izomrétegének és a bél falvastagságának (a villus csúcsától a tunica serosa mesotheliumáig) értékeléséhez állatonként 40 mérést végzett véletlenszerűen vak megfigyelő az egyes szegmensek mindegyik változójára az Image Pro Plus alkalmazásával. 4.5 képelemző szoftver (Media Cybernetics, Silver Spring, MD, USA). A digitális képeket nagyfelbontású kamerával (Q Color 3 Olympus American, Burnaby, BC, Kanada) készítettük mikroszkóppal (Olympus BX 41, Olympus, Tokió, Japán), a Q Capture Pro 5.1 szoftverrel.

A sejtproliferáció, a serleg és az enteroendokrin sejtek, valamint az intraepithelialis limfociták mennyiségi elemzése

Az elemzéseket félsoros szövettani metszetekkel végeztük, amelyeket az alábbi módszerekkel festettünk. A HE-módszert alkalmazták a sejtproliferáció számszerűsítésére a metafázisos index és az intraepithelialis limfociták (IEL) mennyiségi meghatározásával. A hisztokémiai periodikus sav-Schiff (PAS) technikát alkalmazták semleges mucint tartalmazó serlegsejtek mennyiségi meghatározására [19]. Az enteroendokrin sejtek mennyiségi meghatározásához a hisztokémiai Grimelius-technikát alkalmaztuk, amely ezüsttel történő impregnálást [20] tartalmazott.

A serlegsejteket és az IEL-eket mennyiségileg meghatároztuk a villusokban. A kelyhek vagy IEL-ek számát a villus egyik oldaláról és az ugyanazon az oldalon lévő összes sejtszámot megszámláltuk, összesen körülbelül 2500 sejtet alkalmazva minden egyes technikánként minden állatnál. Az enteroendokrin sejtek számát hasonlóan számoltuk a kripta-villus tengelyben, mindegyik állatban kb. 2500 sejt/szegmens.

A metafázisos indexet úgy határoztuk meg, hogy megszámoltuk a metafázisban lévő sejtek számát a kripták egyik oldaláról és a kriptasejtek teljes számát.

A kvantifikációkat Zeiss Primo Star mikroszkóppal (Carl Zeiss, Jena, Németország) végeztük 400-szoros nagyítással. Az adatokat úgy adjuk meg, hogy az összes sejtszámra jutó specifikus sejtpopulációk száma szorozva 100-mal.

Statisztikai analízis

3. táblázat

A kontrollcsoportban (CON csoport) és a magas zsírtartalmú diétával táplált csoportban (OB csoport) értékelt paraméterek

CONOB

Testtömeg (g)	41,7 ± 1,3	47,7 ± 1,6 * a
Zsigeri zsír (g)	1,6 ± 0,2	3,9 ± 0,3 *** a
A vékonybél hossza (cm)	56,8 ± 1,8	51,2 ± 1,3 * a
A duodenum kerülete (cm)	0,6 ± 0,02	0,5 ± 0,05 b
A jejunum kerülete (cm)	0,5 ± 0,02	0,5 ± 0,0002 b
Az ileum kerülete (cm)	0,5 ± 0,02	0,3 ± 0,02 * b

Az eredményeket átlag ± SEM-ben fejezzük ki (n = 10). * p párosítatlan t-teszt; b nem paraméteres teszt.

Neuronális morfológia és sűrűség

A diétától függetlenül a myentericus plexus általános szervezete változatlan volt. Különböző méretű miozin-V-IR idegsejtek főleg a ganglionokban, és ritkán az idegrostok mentén helyezkedtek el (1. ábra). A nitrerg idegsejtek szubpopulációja főleg perifériásan helyezkedik el a ganglionban (1. ábra).