A C57BL/6N és C57BL/6J alvonatokban a magas zsírtartalmú étrend által kiváltott elhízásra adott különböző válaszokhoz kapcsolódó genetikai lokuszok azonosítása

Orvostudományi, Endokrinológiai és Diabétesz Tanszék, Lipcsei Egyetem, Lipcse, Németország;

Biokémiai Intézet, Lipcsei Egyetem, Lipcse, Németország;

IFB AdiposityDiseases, 2. junior kutatási csoport „Az elhízás állatmodelljei”, Lipcsei Egyetem, Lipcse, Németország; és

Orvostudományi, Endokrinológiai és Diabétesz Tanszék, Lipcsei Egyetem, Lipcse, Németország;

IFB AdiposityDiseases, Lipcsei Egyetem, Lipcse, Németország

Orvostudományi, Endokrinológiai és Diabétesz Tanszék, Lipcsei Egyetem, Lipcse, Németország;

Lipcsei Egyetem, Lipcsei Egyetem, Orvostudományi, Endokrinológiai és Diabetes Tanszék, Németország;

Orvostudományi, Endokrinológiai és Diabétesz Tanszék, Lipcsei Egyetem, Lipcse, Németország;

IFB AdiposityDiseases, Lipcsei Egyetem, Lipcse, Németország

Orvostudományi, Endokrinológiai és Diabétesz Tanszék, Lipcsei Egyetem, Lipcse, Németország;

IFB AdiposityDiseases, Lipcsei Egyetem, Lipcse, Németország

Orvostudományi, Endokrinológiai és Diabétesz Tanszék, Lipcsei Egyetem, Lipcse, Németország;

IFB AdiposityDiseases, 2. junior kutatási csoport „Az elhízás állatmodelljei”, Lipcsei Egyetem, Lipcse, Németország; és

Az újranyomtatási kérelmek és egyéb levelezések címe: N. Klöting, Oszt. Orvostudományi, Endokrinológiai és Diabétesz, Lipcsei Egyetem, Lipcse, Németország (e-mail: [e-mail védett]).

Absztrakt

A C57BL/6J és a C57BL/6N egerek között egy alaposan vizsgált genetikai különbséget találtak a nikotinamid-nukleotid-transzhidrogenázban (Nnt) gén a 13. kromoszómán. A C57BL/6J törzsben egy missense (metionin-treonin) mutáció kombinálva a kereten belüli 5 exon deléciós mutációval (négy feltételezett transzmembrán hélix kiküszöbölésével) csonka Nnt variánst eredményez, és jelentősen alacsonyabb Nnt fehérje expresszió a májban és a szigeteken (14, 46). Az Nnt aktivitást a glükóz anyagcseréjének és az inzulin szekréciójának károsodásához kötik (13, 46).

Az egy nukleotid polimorfizmusok (SNP) legújabb genotipizálása további genetikai különbségeket azonosított a C57BL/6J és a C57BL/6N alszármazékok között 11 lokuszon (24, 31, 51). Egy SNP-t találtak a C57BL/6J alszármazékok között, míg a C57BL/6N alszármazékok között nem észleltek genetikai különbséget (31, 51). Az 11 géntérkép közül öt az ismert géneken belül. A 14-es fibroblaszt növekedési faktor genotípusa (Fgf14), A LIM és az öregedő sejt antigénszerű doménjei 1 (Lims1), amiloid prekurzorszerű protein 2 (Aplp2), és az oldható n-etil-maleimid-érzékeny faktor kötődési fehérje 29 (Snap29) különbözik a C57BL/6N és a C57BL/6J törzsek és az N-acetilezett alfa-kapcsolt savas dipeptidáz-szerű 2-hez kapcsolódó SNP között (Naaladl2) bizonyos C57BL/6J alvezetékek között.

A magas zsírtartalmú étrend (HFD) által kiváltott elhízásról szóló tanulmányok különbségeket tártak fel a C57BL/6NTac és a C57BL/6JRj alszövetek között a HFD-re adott válaszuk és a DIO kialakulása tekintetében (36). A közelmúltban fenotípusos különbségekről számoltunk be HFD körülmények között a C57BL/6NTac és a C57BL/6JRj alvonatok között, és megállapítottuk, hogy a C57BL/6JRj törzs a fizikai aktivitástól és a táplálékfelvételtől függetlenül védett a DIO ellen (24).

A C57BL/6J és C57BL/6N egerekben a változó HFD-válaszkészség és DIO megnyilvánulás alapjául szolgáló ok-okozati genetikai különbségek meghatározásához genetikailag és fenotípusosan jellemeztük a C57BL/6NTac és C57BL/6JRj egerek első backcross (BC1) hibridjeit [( C57BL/6NTac × C57BL/6JRj) F1 × C57BL/6NTac]. Ezen felül annak felmérésére, hogy az SNP polimorfizmusai befolyásolhatják-e az mRNS szintjét, valós idejű gén expressziós elemzést végeztünk egér májmintákban és humán szubkután zsírszövetben.

Állatok és fenotipizálás.

Minden kísérlet megfelelt a Útmutató a laboratóriumi állatok gondozásához és használatához kiadta az Egyesült Államok Nemzeti Egészségügyi Intézete (85-23. kiadvány, felülvizsgált 1996), és a németországi Szászország tartomány helyi hatóságai (Regierungspräsidium Leipzig) jóváhagyták, a felelős helyi állatetikai felülvizsgálati bizottság ajánlása szerint.

SNP genotipizálás.

A DNS-t a farokcsúcsokból DNeasy kit segítségével (Qiagen, Hilden, Németország) extraháltuk. Az SNP genotipizálást a TaqMan SNP Genotyping assay segítségével végeztük a gyártó protokolljának megfelelően (Applied Biosystems, Foster City, CA). A genotipizálás reprodukálhatóságának felmérése érdekében az SNP-k esetében a minta véletlenszerű, 5% -os szelekcióját regenotipizáltuk; az összes genotípus megfelelt a kezdeti kijelölt genotípusoknak. Továbbá az F1 hibridekből és a szülői törzsekből származó genomi DNS szolgált kontrollként. Az összes SNP hívási aránya 98 és 100% között mozgott.

Kifejezéselemzés.

A teljes RNS-t elkülönítettük a fagyasztott májból (n = 7 genotípusonként) és a szubkután zsírszövetn = 6 genotípusonként) minták RNeasyMini Kit (Qiagen) alkalmazásával. Az RT-PCR-t TaqMan 7500 rendszerrel (ABI, Darmstadt, Németország) végeztük. 36B4 belső referenciaként használták. A következő primereket használtuk: Snap29 5'-AGGCTACAGGATGCAGAACTAGACT-3 '(előre) és 5'-TGTCATCCTGTTCCTCAATTTCT-3' (hátramenet), Aplp2 5′-CCGAATGGACAGGGTAAAGA-3 ′ (előre) és 5′-CACAAGCTGCTGCTTCTCAC-3 ′ (hátramenet), Lims1 5'-GGAGCTGAAAGGGGGCTAT-3 '(előre) és 5'-TGCCCAAGAAATGGTTTTTC-3' (hátramenet), Snca 5'-CAGAGGCAGCTGGAAAGACA-3 '(előre) és 5'-CACCACTGCTCCTCCAACAT-3' (hátramenet). A relatív génexpressziót a standard görbe módszerrel számítottuk.

Humán tantárgyak.

A szubkután zsírszövetet 234 kaukázusi férfitól nyerték (n = 84) és a nőkn = 150) akik nyílt hasi műtéten estek át kolecisztektómia, vakbélműtét, súlycsökkentő műtét, hasi sérülések vagy exploratív laparotómia miatt (1. táblázat). Az életkor 18 és 89 év között, a testtömeg-index (BMI) 14,1 és 71,0 kg/m 2 között változott. Hatvankilenc alanynak volt 2. típusú cukorbetegsége. Valamennyi alanynak stabil volt a súlya, a testtömeg 3% -át meghaladó ingadozások nélkül, legalább 3 hónapig a műtét előtt. Súlyos betegségeket, beleértve generalizált gyulladást vagy végstádiumú rosszindulatú betegségeket, kizártunk a vizsgálatból. A zsigeri és a szubkután zsírszövet mintáit magyarázat után azonnal folyékony nitrogénben lefagyasztották. A tanulmányt a Lipcsei Egyetem (Németország) Etikai Bizottsága hagyta jóvá. Valamennyi alany írásos tájékozott beleegyezést adott, mielőtt részt vett a tanulmányban.

1. táblázat: A vizsgálati csoportok antropometriai és metabolikus jellemzői

Az adatok átlag ± SD; n = 234.

SC, szubkután; CT, számítógépes tomográfia; BMI, testtömeg-index; WHR, derék-csípő arány; FPG, éhomi plazma glükóz; FPI, éhomi plazma inzulin; OGGT, orális glükóz tolerancia teszt.

Statisztikailag szignifikáns különbségek a nemek között P érték

* † ‡

ÁBRA. 1.A magas zsírtartalmú étrend által kiváltott elhízás megnyilvánulása a szülői alszövetekben, az F1 és BC1 hibridekben. A szülői C57BL/6JRj és C57BL/6NTac testtömeg-növekedése az F1 egerekhez (nőstények, 6 hét HFD) képest (A) vagy összehasonlítjuk a BC1 hibrideket hordozó jótékony vagy kockázati allélokkal (hím egerek, 8 hét HFD)B). A hím C57BL/6JRj és C57BL/6NTac szülő testtömege, valamint a jótékony és kockázati allélek BC1 hordozói 8 hét után HFD alatt (C). Hasznos allélkombináció: (C/C) rs13480122Aplp2és (C/T) rs 13481014; kockázati allél-kombináció: (C/T) az rs13480122-bőlAplp2) és (C/C) rs 13481014. Az adatokat átlag ± SD értékként adjuk meg. P értékek * 0,05, ** 0,01 szinten. BC1, első hátkereszt; HFD, magas zsírtartalmú étrend.

2. táblázat: A magas zsírtartalmú étrend okozta testtömeg-növekedés a backcross hibridekben és a szülői kontroll törzsekben

Az adatok jelentése ± SD. Szuggesztív összefüggés a genotípus variánsai között (nem javított P értékek * 0,05, † 0,01 szintnél).

‡ Jelentős kapcsolat a genotípus variánsok között (P értékek

3. táblázat: Specifikus szervtömegek és éhomi szérumkoncentrációk a BC1 hibridekben és a szülői kontroll törzsekben

Az adatok jelentése ± SD. Szuggesztív összefüggés a genotípus variánsai között (nem javított P értékek * 0,05, † 0,01 szintnél).

BC1, első hátkereszt; Epi, epigonadal.

Hasznos allélkombináció: hím egerek, rs13480122 (C/C) és rs13481014 (C/T); nőstény egerek (G/G) rs13478783 esetében és (C/C) rs4165065 esetében. Kockázati allél kombináció: hím egerek, (C/T) rs13480122 esetében és (C/C) rs13481014 esetében; nőstény egerek, (G/A) rs13478783 és (C/T) rs4165065 esetén. A Boldface kiemeli a szuggesztív és jelentős asszociációkat.

A nőstény BC1 egerek esetében az rs13478783 (G/G) és az rs4165065 (C/C) SNP-k homozigóta hordozói kevesebb súlyt kaptak 8 hét HFD után (2. táblázat), de a heterozigóta alomtársakhoz képest csak lényegtelenül alacsonyabb epigonadal zsírtömeg mutatkozott ( 3. táblázat).

Mindkét nem esetében szuggesztív/nominális összefüggéseket találtunk az rs13478783 (G/G), rs13481014 (C/T) és az alacsonyabb szérum leptinszintek között (3. táblázat). Ezenkívül és csak férfiaknál az rs13478783 (G/G) alacsonyabb szérum inzulin-koncentrációval társult P értéke 30 kg/m 2 szignifikánsan alacsonyabb szubkután SNAP29 mRNS expresszió az elhízott alcsoportban (2. ábraC). A teljes vizsgálati populáció egyváltozós korrelációs elemzése (n = 234) szignifikáns összefüggéseket azonosított a szubkután SNAP29 génexpresszió és BMI (r = −0,267, P

ÁBRA. 2.Relatív génexpressziós elemzés egér májban (A) és a szubkután zsírszövet (B) nak,-nek Snap29, Snca, Aplp2 különböző genotípusokban és SNAP29 mRNS szint az emberi szubkután zsírszövetben (C). A jelen eredmények átlagértéke ± SE n = 6 máj- és szubkután zsírszövetminta genotípusonként. A jelen eredmények a sovány alanyok ± SE értékét jelentik (n = 44) vs. elhízott alanyok (n = 190). *P

4. táblázat: Egyváltozós összefüggések a humán SNAP29 mRNS expresszió és az elhízás, a zsíreloszlás, a glükóz, valamint a lipid metabolizmus és az adipokinek paraméterei között

Ezenkívül az SNP rs4165065 nőspecifikus hatást mutat a DIO térképeken a Snap29 gén, amely az agyi dysgenesishez, a neuropathiához, az ichthyosishoz és a keratoderma (CEDNIK) szindrómához és a skizofréniahoz kapcsolódik (15, 39, 42). Az SNAP29 a SNAP receptor (SNARE) fehérjecsalád tagja, amelyek szükségesek a vezikulák kereskedelméhez, és ezért nélkülözhetetlenek számos fiziológiai folyamatban (7, 49). Úgy tűnik, hogy a SNARE fehérjék elsősorban a vezikulák és a célmembrán közötti fúzió közvetítéséért felelősek (11). Két funkcióvesztéses mutáció a Snap29 gén embernél neurokután CEDNIK szindrómát eredményez (15, 42). Molekuláris szinten az SNAP29 elvesztése a transzferrin és a β1-integrin újrafeldolgozásának károsodását eredményezte, bemutatva az SNAP29 által közvetített membránfúzió fontosságát az endocita újrafeldolgozásban és következésképpen a sejtek mozgékonyságában (37). Beszámoltak arról, hogy az SNAP29 jelen van a szinapszisokban és gátolja a SNARE komplex szétszerelését, és úgy tűnik, hogy modulálja a SNARE komponensek szinaptikus átvitelét és posztfúziós újrahasznosítását (44).

Az SNP rs13478783 150 kb-tal az α-szinukleintől felfelé helyezkedik el (Snca) gén. Az SNCA elsősorban arról ismert, hogy számos neurodegeneratív állapot, például a Parkinson-kór, amelyet ma szinukleinopátiának neveznek, molekuláris jellegzetességeként kiemelkedően fontos szerepet játszik (41). Meggyőző bizonyíték van az SNCA szerepéről a szinaptikus-vezikuláris felszabadulás szabályozásában, ami stabilizáló hatást mutat a SNARE család fehérjéinek komplexeire (9, 26, 34). Ebben az összefüggésben kimutatták, hogy az SNCA az inzulinszekréciós granula citoplazmatikus liganduma, és kölcsönhatásba lép a KATP csatornákkal, és ennek következtében gátló hatást mutat az inzulin szekréciójára (16). Az SNCA exogén túlzott expressziója gátolta az inzulin szekréciót az INS1-832/13 sejtekben, míg az SCNA expresszió elvesztése az SNCA hiányos ASKO szigeteken fokozta az inzulin szekrécióját (16). Ezenkívül a legújabb tanulmányok kimutatták az SNCA expressziója által indukált gyulladásos ingereket a makrofágokban és az SNCA eredendő makrofág-aktivációs képességét a fehérje NH2-terminális és COOH-terminális doménjeitől függően (27, 45). Az SCNA gyulladásos folyamatokban való esetleges szabályozó szerepe összefüggést mutathat az SCNA és a zsírszövet, valamint az elhízás között, mivel az elhízás szisztémás és krónikus, alacsony fokú gyulladás állapotaként jól bevált.

Annak felmérése, hogy az SNP különbségek befolyásolhatják-e Snap29, Aplp2, és Snca expresszióját, C57BL/6JRj, C57BL/6NTac és heterozigóta egerek valós idejű alapú génexpresszióját vizsgáltuk májmintákban. Itt azt találtuk Snap29 Az mRNS a C57BL/JRj egerek máj- és zsírszövetében szignifikánsan fel van szabályozva, jelezve a genotípus és az mRNS szint közötti összefüggést. Mivel úgy tűnik, hogy a Snap29-nek a legerősebb hatása van egerekben, gének expressziós elemzését végeztük a szubkután emberi zsírszövetben is. Összehasonlítása SNAP29 Az mRNS expressziója a 30 kg/m 2 BMI alcsoportokban szignifikánsan alacsonyabb SC-t mutatott ki SNAP29 mRNS expresszió az elhízott alcsoportban (2. ábraB), jelezve az összefüggést SNAP29 mRNS szint és az elhízás mértéke. A teljes vizsgálati populáció egyváltozós korrelációs elemzése jelentős összefüggéseket azonosított, elsősorban az elhízás és a zsíreloszlás paramétereivel kapcsolatban. Ezek az összefüggések nem maradtak szignifikánsak az életkor, a nem és a BMI után, és több teszt elvégzéséhez korrigálták őket. Ezek az expressziós adatok arra utalnak, hogy az SNAP29 szerepet játszhat az elhízás és/vagy a DIO megnyilvánulásában.

Következtetés

Összefoglalva, azonosítottunk nemspecifikus SNP-ket a C57BL/6NTac és a C57BL/6JRj alvonatok között, amelyek a testtömeg-gyarapodáshoz és a relatív zsírraktár-tömeghez kapcsolódnak HFD alatt a C57BL/6NTac és C57BL/6JRj egerek BC1 hibridjeiben [(C57BL/6NTac × C57BL/6JRj) F1 × C57BL/6NTac]. Az ismert géneken belüli vagy közeli SNP-k feltérképezéséhez, Aplp2, Snap29, és Snca mind súlyos neurodegeneratív vagy neurokután betegségekben vagy szindrómákban vesznek részt. Gének expressziós elemzése egerekben és emberi szövetekben azonosítva Snap29 mint az elhízással és a zsíreloszlással kapcsolatos paraméterek legerősebb jelöltje. És bár e gének molekuláris funkcióinak ismerete és megértése általában korlátozott, az ebben a tanulmányban a DIO megnyilvánulásával összefüggésben közölt SNP-vel kapcsolatos gének mindegyikének bizonyos közös funkcionális alapja van, mivel részt vesz a szinaptikus vezikulák felszabadulásában és a SNARE komplex stabilitásában.

Adataink azt mutatják, hogy a DIO reagálóképesség a C57BL/6NTac és a C57BL/6JRj alvonatok közötti genetikai eltérésekkel jár, és arra utalnak, hogy a szinaptikus vezikulák felszabadító rendszerének génjei részt vesznek a magas zsírtartalmú DIO szabályozásában.

Ezt a munkát a Deutsche Forschungsgemeinschaft, az SFB1052 „Elhízási mechanizmusok” (B1 M. Blüher, B4 N. Klöting, C7 J. T. Heiker) és a Szövetségi Oktatási és Kutatási Minisztérium (FKZ: 01EO1001 (N. Klöting)) támogatásával támogatták.