A polyIC által kiváltott immunválasz változékonysága: Következmények az anya preklinikai immunaktivációs modelljeire

Milo Careaga

Pszichiátria és Magatartástudományi Tanszék, Kalifornia Egyetem, Davis, USA

b A MIND Intézet, Kaliforniai Egyetem, Davis, USA

Sandra L. Taylor

c Kaliforniai Egyetem, Egészségügyi Tudományok Tanszék, Davis, USA

Carolyn Chang

b A MIND Intézet, Kaliforniai Egyetem, Davis, USA

Alex Chiang

Pszichiátria és Magatartástudományi Tanszék, Kalifornia Egyetem, Davis, USA

b A MIND Intézet, Kaliforniai Egyetem, Davis, USA

Katherine M. Ku

Pszichiátria és Magatartástudományi Tanszék, Kalifornia Egyetem, Davis, USA

b A MIND Intézet, Kaliforniai Egyetem, Davis, USA

Robert F. Berman

b A MIND Intézet, Kaliforniai Egyetem, Davis, USA

d Neurológiai Sebészeti Osztály, Kaliforniai Egyetem, Davis, USA

Judy A. Van de Water

b A MIND Intézet, Kaliforniai Egyetem, Davis, USA

Belgyógyászat, Reumatológiai Osztály, Kaliforniai Egyetem, Davis, USA

Melissa D. Bauman

Pszichiátria és Magatartástudományi Tanszék, Kalifornia Egyetem, Davis, USA

b A MIND Intézet, Kaliforniai Egyetem, Davis, USA

f Kaliforniai Nemzeti Prímáskutató Központ, Kaliforniai Egyetem, Davis, USA

Társított adatok

Absztrakt

Az anyai fertőzés terhesség alatt növelheti az utódok neurodevelopmentális rendellenességeinek kockázatát. A preklinikai poliinozin-policitidilsav (PolyIC) modell az egyik legszélesebb körben alkalmazott megközelítéssé vált az anya immunaktivációs (MIA) kutatásában. A molekulatömeg változékonysága azonban befolyásolhatja a PolyIC immunaktiváló potenciálját. A nagy molekulatömegű PolyIC-nal injektált nulliparous patkányok kifejezett citokinválaszt és betegségbeli viselkedést mutatnak, amelyet nem figyeltek meg az alacsony molekulatömegű PolyIC injekcióval ellátott patkányokban. Bár elengedhetetlen következő lépés e vizsgálatok kiterjesztése a vemhes állatokra, az előzetes eredmények azt sugallják, hogy a PolyIC molekulasúly fontos kísérleti tervezési szempont.

1. Bemutatkozás

2. Módszerek

Valamennyi eljárást a Kaliforniai Egyetem Davis Intézményi Állattenyésztési és Felhasználási Bizottságának jóváhagyásával hajtották végre, összhangban az Országos Egészségügyi Intézet által az állatok tudományos kezelésére vonatkozó iránymutatásokkal. Az adatok kérésre rendelkezésre állnak.

2.1. Állatok

8 hetes nőstény Sprague-Dawley patkányokat (Harlan Sprague-Dawley, Inc., Indianapolis, IN) a Kaliforniai Egyetemen (Davis) az Oktató és Kutató Állatgondozó Szolgálat (TRACS) tartott fenn. Valamennyi patkányt párban, hőmérséklet és páratartalom mellett szabályozott viváriumban helyeztük el, és szobahőmérsékleten 22,9 ° C és 53% páratartalom mellett tartottuk 12 órás világos/sötét ciklusban (a fény 06:00 órakor világított). A szokásos házi ketrec ház a Lab Products polipropilén egyénileg szellőző ketrec (IVC) házrendszereiből állt, 30,5 cm × 35,6 cm × 20,3 cm méretű, magas felső drótfedéllel, csutka ágyneművel és fészkeléssel. Azok az őrszemállatok, amelyek maximálisan ki vannak téve a vivárium összes többi állatának, egy átfogó egészségfigyelő program részét képezik, amelyet a telepen esetlegesen előforduló fertőzések kimutatására használnak. Az élelmiszer és a víz ad libitum volt a vizsgálat során. A patkányoknak hagyni kellett a viváriumhoz szokni, miután legalább két hétig megérkeztek a Harlan laboratóriumokba, mielőtt bármilyen eljárást elvégeztek volna.

2.2. Kagyló

A CLAMS (Comprehensive Lab Animal Monitoring System) az anyagcsere-ketrecek rendszere, amely lehetővé teszi számos anyagcsere-paraméter egyidejű mérését, beleértve az oxigénfogyasztást, a szén-dioxid-termelést, az élelmiszer-fogyasztást, a mozgásszervi aktivitás szintjét stb. A CLAMS házat 24 ° C-on és 55% páratartalom mellett tartották. A ketrecek fény- és hőmérséklet-szabályozott környezetbe vannak zárva, így a felhasználó változatos környezeti hőmérsékleten gyűjthet adatokat. A CLAMS környezetét 24 ° C-on tartottuk 12 órás világos/sötét ciklus alatt (a fény 06:00 órakor világított). Az ételt és a vizet ad libitum szolgáltatták. A vizet, az ételt, az O2-fogyasztást, a CO2-termelést és az aktivitást 24 órán keresztül ellenőriztük a Poly IC vagy a hordozó injekciója előtt és 24 órán keresztül. Az állatokról rögzítettük az adatokat, miután az injekciókat követően visszatették őket a CLAMS-be.

2.3. Immunaktiválás

2.4. Vérgyűjtés

Vért vettünk patkányokból három időpontban; 3, 4,5 és 6 órával az injekció beadása után. A patkányokat külön-külön eltávolítottuk a CLAMS-ból és érzéstelenítés nélkül visszatartottuk, miközben 26 g-os tűvel 100 μl vért gyűjtöttünk a farokérből. A hőmérsékletet rektálisan vettük, és közvetlenül a vérvétel előtt rögzítettük. A vérvétel általában 5 percen belül befejeződött. A vért legalább egy órán át hagytuk alvadni, majd 10 percig 1000 g-vel centrifugáltuk. A szérumot összegyűjtöttük és -80 ° C-on tároltuk, amíg a citokinszintet elemeztük. A 4,5 órás időmintákat archiváltuk a jövőbeni összehasonlítás céljából a vemhes patkányoktól a PolyIC injekciókat követően gyűjtött mintákkal, így a jelen vizsgálat csak a 3 és a 6 órás pontokat tartalmazza.

2.5. Citokin elemzés

Az IL-1β, IL1-a, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-12, IL-13, IL-17, GM-CSF, IFN szérum citokinek szintje -γ és TNFα értékeket patkány multiplexáló gyöngy immunvizsgálatokkal (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) határoztuk meg. A mintákat a gyártó specifikációi szerint két példányban futtattuk. Valamennyi mintát 1: 4 arányban hígítottuk a gyártó által biztosított minta hígítóban. 50 μL hígított szérumot inkubáltunk antitesthez kapcsolt gyöngyökkel. Mosássorozat után biotinilezett antitest detektálást adtak a gyöngyökhöz, és a reakcióelegyet sztreptavidin-fikoeritrin hozzáadásával detektálták. A gyöngykészleteket áramlásalapú Luminex ™ 100 szuszpenziós tömbrendszer (Bio-Plex 200; Bio-Rad Laboratories) segítségével elemeztük. Az ismeretlen minta citokinkoncentrációkat a Bio-Plex Manager szoftverrel számoltuk ki, a gyártó által megadott ismert referencia citokin koncentrációkból levezetett standard görbét használva. A végső koncentrációk kiszámításához ötparaméteres modellt használtak. A kimutatási érzékenységi határ (LOD) alatt kapott koncentrációkat statisztikai összehasonlítás céljából LOD/2-nek számítottuk. A felülúszó alikvot részek mentesek voltak a korábbi fagyasztási/olvadási ciklusoktól. A minták csak 2% -a haladta meg a 15% -os CV variancia megengedett értéket, és ezt követően újra elemezték.

2.6. Statisztikai analízis

3. Eredmények

3.1. Citokin különbségek a csoportok között

IL-6 válasz a PolyIC injekciót követően. Csak azok az állatok mutatják meg az IL-6 szintet, amelyek HMW-PolyIC-t kaptak, az injekció után 3 és 6 órával a fiziológiás sóoldathoz képest. * P 4. táblázat. Csak a HMW-PolyIC-et kapó állatoknál mutatkozott súlycsökkenés, az O 2 -fogyasztás/CO 2 -termelés változásai és csökkent etetési és ivási magatartás a sóoldattal injektált állatokhoz képest (3. ábra). Azok az állatok, amelyek LMW-PolyIC-t kaptak, nem különböztek a kontrollaktól. A mag testhőmérsékletének és aktivitásának mérése nem különbözött a három kezelési csoport között.

Az LMW-PolyIC-t kapó patkányok nem mutattak szignifikáns különbségeket a kizárólag sóoldatot kapó patkányokhoz képest. A HMW-PolyIC-et kapó patkányok azonban szignifikáns különbségeket mutattak az (A) súlycsökkenés, (B) CO2-termelés, (C) O2-fogyasztás, (D) táplálék-bevitel és (D) víz-bevitel tekintetében a sóoldatot kapó patkányokhoz képest. * P sóoldat (p 1. táblázat). Jelentős kölcsönhatásokat találtunk a kezelési csoport és az idő között IL-6, TNFα, IL-1β és IFN-y esetében. Mind az IL-6 (1. ábra), mind az IFN-y (2. ábra) esetében a HMW-PolyIC injekcióval ellátott állatok szignifikánsan magasabb szintet mutattak a sóoldat kontrollhoz képest mind az injekció után 3, mind 6 órával. Bár az LMW-PolyIC injekcióval ellátott állatok IL-6 és IFN-y szintje is magasabb volt, mint a kontrollok, ezek a különbségek egyik időpontban sem voltak szignifikánsak. A TNFα és az IL-1β (2. ábra) mindkét időpontban szignifikánsan különbözött a HMW-PolyIC injekcióval kezelt állatok és a kontrollok között, bár az LMW-PolyIC injekcióval beadott állatok csak 3 órával különböztek a kontrollaktól, de az injekció beadása után 6 órával nem. A többi citokin esetében, amelyek nem mutattak szignifikáns interakciót a kezelési csoport és az idő között, az átlagos szintek szignifikánsan különböztek a HMW-PolyIC injekcióval kezelt állatok és a kontrollok között, de az LMW-PolyIC injekcióval kezelt állatok és az összes citokin esetében a kontrollok kivételével a GM-CSF kivételével (2. táblázat, 3; 3; Kiegészítő anyag).

Eredményeink azt mutatják, hogy a változó molekulatömegű PolyIC jelentősen eltérő citokinválaszokat és betegségi viselkedést indukálhat in vivo, ami hozzájárulhat az MIA-modell folyamatos reprodukálhatósági problémáihoz (Begley és Ioannidis, 2015). Ezek az eredmények összhangban vannak a korábbi sejtstimulációs vizsgálatokkal (Mian és mtsai, 2013; Zhou és mtsai, 2013), és betekintést nyújtanak a PolyIC immunaktiváló tulajdonságok változékonyságáról szóló jelentések lehetséges mechanizmusaiba (Harvey és Boksa, 2012). Tekintettel arra, hogy a terhesség megváltoztatja az anya immunválaszát, elengedhetetlen következő lépés a HMW-PolyIC és LMW-PolyIC citokinválaszok és a betegség viselkedésének jellemzése terhes állatoknál. Mialatt gravid állatokon folynak a kísérletek, itt bemutatjuk előzetes eredményeinket, amelyek kihatással vannak a MIA modellkutatás növekvő területére, és módszertani betekintést nyújthatnak az értékes fordítási modell szigorának és reprodukálhatóságának javításához.

Kiegészítő anyag

Kiegészítő

Köszönetnyilvánítás

Ezt a kutatást a MIND Intézet értelmi és fejlődési fogyatékosságokkal foglalkozó kutatóközpontjának (U54> HD079125) és az UC Davis Magatartási Egészségügyi Kiválósági Központjának M.D.B-nek nyújtott kísérleti díjai támogatták. M.C. támogatta az UC Davis Autizmus Kutató Képzési Programja (T32MH073124) és az UC Davis Magatartási Egészségügyi Kiválósági Központja. A szerzők szeretnék megköszönni Peter Takeuchinak, Josef Riverának és az UC Davis Rat Behavior Phenotyping Laboratory-nak a CLAMS és az általános állatgondozás terén nyújtott széleskörű segítségüket. Ezúton is szeretnénk köszönetet mondani az UC Davis értelmi és fejlődési fogyatékosságokkal foglalkozó kutatóközpont (IDDRC) biológiai elemzési központjának, és különösen Lori Haapanennek a citokinek számszerűsítésében nyújtott segítségért, valamint a Biostatisztikai, Bioinformatikai és Kutatási Tervező Alapnak a statisztikai elemzések.

Lábjegyzetek

A szerzők kijelentették, hogy nincsenek versengő érdekek.