A rapamicin rontja a HPD által kiváltott jótékony hatásokat a glükóz homeosztázisra

Geng-Ruei Chang

1 Állatorvos-tanszék, Nemzeti Csung Hszing Egyetem, Tajcsung, Tajvan

2 Maradékellenőrzés, Mezőgazdasági Vegyszerek és Mérgező Anyagok Kutatóintézete, Mezőgazdasági Tanács, Taichung, Tajvan

Yi-Shin Chiu

1 Állatorvos-tanszék, Nemzeti Csung Hszing Egyetem, Tajcsung, Tajvan

Ying-Ying Wu

1 Állatorvos-tanszék, Nemzeti Csung Hszing Egyetem, Tajcsung, Tajvan

Yu-Chi Lin

1 Állatorvos-tanszék, Nemzeti Csung Hszing Egyetem, Tajcsung, Tajvan

Po-Hsun Hou

1 Állatorvos-tanszék, Nemzeti Csung Hszing Egyetem, Tajcsung, Tajvan

3 Pszichiátriai Osztály, Taichung Veterans General Hospital, Taichung, Tajvan

Frank Chiahung Mao

1 Állatorvos-tanszék, Nemzeti Csung Hszing Egyetem, Tajcsung, Tajvan

Társított adatok

S1. Táblázat A kísérleti étrendek összetétele.

S2. Táblázat A rapamicin hatása a testtömegre, az anyagcsere-hatásokra, a szérum leptinszintre, a szervek súlyára és a zsíros máj pontszámokra 35 napig vivőanyaggal vagy rapamicinnel kezelt sovány egereknél.

Absztrakt

Háttér és cél

A rapamicint, amelyet klinikailag a graft kilökődésének kezelésére alkalmaznak, szintén javasolták, hogy hatással legyen a metabolikus szindrómára; sovány állatok/emberek hatásairól azonban nagyon kevés információ áll rendelkezésre. A vizsgálat célja a rapamicin folyamatos alkalmazásának a glükóz homeosztázisra gyakorolt hatásának további jellemzése sovány C57BL6/J egerekben.

Kísérleti megközelítés

Az egereket 12 hétig magas fehérjetartalmú étrenddel (HPD) táplálták, hogy kialakuljon a sovány modell, majd naponta 5 hétig rapamicinnel kezelték őket, miközben HPD-n maradtak. Metabolikus paramétereket, endokrin profilokat, glükóz tolerancia teszteket, inzulinérzékenységi indexet, a glükóz transzporter GLUT4 expresszióját és a króm eloszlást mértük in vivo.

Főbb eredmények

Alacsonyabb testtömeg-növekedést, valamint alacsonyabb kalóriabevitelt, zsírpárnákat, zsírmáj pontszámokat, adipocita méretet és glükóz tolerancia teszt értékeket figyeltek meg a HPD-vel táplált egerekben a magas zsírtartalmú vagy szokásos étrenddel etetett egerekhez képest. E jótékony hatások ellenére a rapamicinnel kezelt sovány egerek nagyobb inzulinszintet mutattak nagyobb glükóz-intoleranciában, csökkent inzulinérzékenységben, alacsonyabb izom-GLUT4 expresszióban és változásokban a króm szintjeiben a szövetekben.

Következtetés és következmények

Eredményeink azt mutatják, hogy a folyamatos rapamicin adagolása a cukorbetegség szindróma kialakulásához vezethet, mivel egy sovány állatmodellben hiperglikémiát és glükóz intoleranciát váltottak ki.

Linkek táblázatai

CÉLOK

Szállítók a	Enzimek b
GLUT4	Törvény (PKB)
mTOR
S6K1

Ezek a táblázatok ebben a cikkben felsorolják a kulcsfontosságú fehérje-célpontokat és ligandumokat, amelyek hiperhivatkozással kapcsolódnak az IUPHAR/BPS PHARMACOLOGY Guide (Pawson et al., 2014) és az IUPHAR/BPS Guide (Pawson et al., 2014) és az IUPHAR/BPS Guide közös adatportáljának megfelelő bejegyzéseihez. véglegesen archiválják a FARMAKOLÓGIA 2013/14 összefoglaló útmutatójában (a, b Alexander et al., 2013a, b).

Bevezetés

A 2-es típusú cukorbetegség egy elismert tápanyag-túlterhelési rendellenesség, amely elhízott egyéneknél jelentkezik, amikor az inzulin felszabadulása a hasnyálmirigy-béta-sejtek diszfunkciójában nem képes szabályozni a vércukorszintet az inzulinrezisztencia hatására (Kahn et al., 2006). Az energia korlátozása, különösen az energia fehérjeként történő több mint 50% -ának köszönhetően, az elhízás gyakori és sikeres alternatív kezelési módja, amely általában hatékony a testsúlycsökkenés elérésében és a cukorbetegség további megjelenésének megakadályozásában (St Jeor et al., 2001). Sőt, a magas fehérjetartalmú étrenddel (HPD) táplált 2-es típusú cukorbetegségben szenvedők csökkentették az étkezés utáni vércukorszintet és javították az általános glükózkontrollt (Gannon et al., 2003). Mindazonáltal a magas fehérjetartalmú kiegészítés összefüggésben van a sebgyógyulás elősegítésével, a sokk elleni védekezéssel, az alultápláltsággal, az anaemia kontrolljával, az ödéma kialakulásával és a műtét és égési sérülés utáni immunvédelem fokozásával (Spence et al., 1946).

Mód

Állatok és gyógyszeres kezelés

Az 5 hetes hím C57BL/6J egereket, amelyeket a Tajvani Nemzeti Laboratóriumi Állatközpont, az Education Research Resource munkatársa szerzett be, a tajvani kormány ajánlása szerint a laboratóriumi állatok gondozására és felhasználására vonatkozó irányelveknek megfelelően használtuk. A kísérleti egerek protokollját az Országos Chung Hsing Egyetem Intézményi Állatgondozási és Felhasználási Bizottsága (IACUC) is felülvizsgálta és jóváhagyta (IACUC jóváhagyási szám: 98-85). Minden állatkísérletet az állatokkal végzett kísérletek jelentésére vonatkozó ARRIVE irányelveknek megfelelően jelentenek (Kilkenny et al., 2010; McGrath et al., 2010). Ezekben a kísérletekben összesen 60 állatot használtak fel. Az állatokat érzéstelenítő, uretán (1,2 mg kg -1) kombinált szén-dioxid túladagolásával leöltük.

I. kísérlet

Az állatokat három csoportra osztottuk a sovány állatmodell megállapításához: (i) kontrollcsoport: az egereket szokásos étrenddel etettük (SD; 5008-as étrend, 24% fehérjével dúsított étrend, 49,4% szénhidrát; PMI Nutrition International, Brentwood, MO (USA); (ii) magas zsírtartalmú étrend (HFD) csoport: az egereket HFD-vel etették (592Z diéta, 20,4% fehérjével dúsított étrend és módosított laboratórium 35,5% zsírral; PMI Nutrition International Inc.); (iii) HPD csoport: az egereket HPD (5787-es diéta, 60,0% fehérjével dúsított étrend, PMI Nutrition International Inc.) (S1 támogató információs táblázat) etettük. Az összes csoportot ad libitum-mal etettük 12 hétig. Az egereket egyedileg, műanyag rágcsálóketrecekben helyeztük el állattartó helyeken, ellenőrzött hőmérsékletű (22 ± 1 ° C), páratartalom (55 ± 5%) és 12:12 órás világos-sötét ciklus alatt. Az összes egér testtömegét 12 hétig mértük, majd elemeztük.

II. Kísérlet

Öt hetes hím C57BL/6J egereket 12 hétig HPD-vel etettek, hogy normál glükózszintű sovány állatot fejlesszenek ki, az I. kísérletben leírt előzetes vizsgálatunk után. Az egereket ezután véletlenszerűen két csoportba osztották 17 hetes korukban. Az egerek egyik csoportját intravénásán injektáltuk. rapamicin (2 mg · kg –1 testtömeg) naponta egyszer, 35 napig (HPD-vel táplált, rapamicinnel kezelt egerek; HPDR). Az egerek második csoportja, a HPD kontroll, megfelelő térfogatú vivőanyagot kapott (steril 10% PEG400/8% etanol, majd azonos térfogatú steril 10% Tween 80) (Eshleman és mtsai, 2001; Chang és mtsai., 2009a). A rapamicin ezen adagja egerekben egyenértékű 0,17 mg · kg –1 · nap –1 dózissal emberben, ha a testfelületre normalizálják (Chodera és Feller, 1978; Chang és mtsai, 2009b), hogy utánozzák a tipikus terápiás koncentrációt. klinikai humán vizsgálatokban (Saunders et al., 2001).

Testtömeg, táplálék/kalóriabevitel és hormonkoncentráció mérése

Az egerek testtömegét és táplálékfelvételét hetente rögzítettük és mértük. Az élelmiszer-fogyasztás becsléséhez az ételfogyasztást úgy értékelték, hogy lemérték az egyes ketrecadagolókban lévő ételt, beleértve a ketrec padlójára ömlött ételt is. Ezenkívül a vizsgálati periódus végén az állatokat érzéstelenítettük, és különféle szöveteket, valamint szérumot gyűjtöttünk be a későbbi elemzés céljából. A szérum leptin és inzulin koncentrációkat egér leptin elisa kit és patkány inzulin elisa kit használatával mértük (# 90030 és # INSKR020; Crystal Chem Inc., Downers Grove, IL, USA).

A szövetek szövettani és morfometriai elemzése

Megmértük a szív, a máj, a lép, a vese, a retroperitoneális és az epididymális zsírpárna súlyát; a teljes testtömeg százalékában meghatározva. A májba történő zsírszivárgást haematoxilin- és eozinfestéssel azonosítottuk az alábbiak szerint: nincs látható zsír: pontszám 0; 50% zsír: 4. pont (Chang és mtsai, 2009b).

Számos metszetet kaptunk a retroperitoneális és epididymális zsírszövetekből, és szisztematikusan elemeztük az adipocita méretét és számát illetően. A metszetek festését haematoxilinnel és eozinnal végeztük. Minden mintához diánként legalább 10 mezőt (~ 100 adipocitát képviselő) elemeztünk (Bluher et al., 2004). A képeket nagyfelbontású digitális mikroszkóppal (Moticam 2300, Motic Instruments, Kanada) nyertük, és az adipocita méreteloszlást Motic Images Plus 2.0 szoftverrel elemeztük. Az adipocita méretének és eloszlásának (%) korrelációját meghatároztuk HFD kontroll, HPD kontroll és rapamicinnel kezelt egerek esetén HPD-n.

Glükóz tolerancia teszt

Az I. kísérlet végén egy i.p. glükóz tolerancia tesztet (IPGTT) 1 g · glükóz · kg -1 testtömeg dózisban végeztünk olyan állatoknál, akiket egy éjszakán át éheztek, szabad hozzáféréssel a vízhez. A vércukorszintet 0, 30, 60 és 120 perccel határoztuk meg az i.p. glükóz injekció. A fent említett kísérlet révén a vércukorszintet a farokérből vett vérben mértük a korábban jelzett időpontokban One Touch ™ glükózmérővel (LifeScan Inc., CA, USA). A glükóz tolerancia vizsgálatához kiszámítottuk a glükóz tolerancia görbe alatti területet (0–120 perc). Hasonlóképpen, a II. Kísérletben 28 napos vivőanyaggal vagy rapamicinnel történő kezelés után IPGTT-t is elvégeztek a HPD-vel etetett állatoknál.

Western blot elemzés

Minden kísérlet végén az állatokat érzéstelenítő túladagolással leölték, és a gastrocnemius izmokat gyorsan eltávolították, durván darálták, majd azonnal homogenizálták. Western-blotot hajtottunk végre az előzőekben leírtak szerint (Chang és mtsai., 2009b). A Western blot elemzéshez használt antitestek a következők voltak: anti-GLUT4, anti-foszfo-S6K (foszfotreonin 389-specifikus), anti-S6K és anti-aktin antitestek. Az immunreaktív jeleket fokozott kemilumineszcencia reagensekkel detektáltuk, és a membránokat röntgenfilmeken tettük ki. A fehérje expresszió és a foszforilezés kvantifikálását filmeken végeztük az NIH Scion képprogrammal (Scion Corporation, Frederick, MD, USA).

Krómkoncentrációk elemzése

Statisztikai analízis

Az eredményeket átlag ± SEM-ben mutatjuk be. A két csoport közötti különbségeket t-teszttel elemeztük összehasonlítás céljából. Anova tesztet, majd post hoc Bonferroni tesztet alkalmaztunk a különbségek meghatározására, ha kétnél több csoportot elemeztünk. A 0,05 alatti P-értéket szignifikánsnak tekintették. Fisher pontos tesztjét is alkalmazták a kontingencia adatok jelentőségének értékelésére.

Anyagok

A rapamicin az LC Laboratories-től (Woburn, MA, USA) származott. Az anti-GLUT4, anti-foszfo-S6K, anti-S6K és anti-aktin antitesteket a Cell Signaling Technology-tól (Beverly, MA, USA) szereztük be. A fokozott kemilumineszcencia-reagensek a Pierce Chemical Co.-tól (Rockford, IL, USA) származnak.

Eredmények

A HPD hatása a testtömeg-indexekre, az élelmiszer-/kalóriabevitelre, az élelmiszer-hatékonyságra és a szérum leptinszintre

A hím C57BL6/J egereket SD, HFD vagy HPD-vel etettük 12 hétig. A különböző étrendi bevitel a test metabolikus paramétereinek és a szérum leptin szintjének különbségeihez vezetett (1. ábra). A HPD-vel táplált egerek súlya 12 hét után 9, illetve 19% -kal alacsonyabb volt, mint az SD- és HFD-vel táplált egerek esetében, ami statisztikailag szignifikáns különbséget mutat (1. A. ábra). Ezenkívül a testtömeg-növekedés jelentősen gyengült a HPD-vel táplált egerekben 40, illetve 64% -kal, párhuzamosan az SD-vel és a HFD-csoporttal (1. B ábra). A HPD-vel táplált egereknél azonban szignifikánsan nőtt az átlagos napi táplálékfelvétel (2,59 ± 0,06 vs 2,29 ± 0,04 g/egér nap -1, ill. P 1 C), de a HPD csoport napi kalóriabevitele csökkent (9,76 ± 0,22 vs. Egérnaponként 13,49 ± 0,24 kcal/-1, illetve P 1 D). A HPD csoport napi táplálékfogyasztása és napi kalóriabevitele azonban szignifikánsan alacsonyabb volt (P -1 étel, ill. P -1 étel, P 1 E). A leptin részt vesz az ételbevitel szabályozásában. A HPD-vel táplált egerek szignifikáns 3,2-szeres csökkenést mutattak (P 1 F). Ez az eredmény összhangban van az élelmiszer-beviteli adatokkal. Ezenkívül a HPD-vel táplált egerek szérum leptinszintje 1,7-szeres növekedést mutatott (P * P * * P * * * P 2). A szív, a lép és a vesék kivételével a HPD-vel táplált egerek máj- és epididymális zsírpárnáinak súlya is szignifikánsan alacsonyabb volt, mint az SD csoporté. A HFD csoporthoz képest a máj, a lép, az RWAT és az EWAT súlya a HPD-vel táplált egerekben szignifikánsan alacsonyabb volt, 18, 27, 36, illetve 68% -kal, amikor a testtömegre normalizáltuk (2. ábra). Ezenkívül a máj és az EWAT a testtömeg százalékában a HPD-vel táplált egerekben szignifikánsan, 13, illetve 31% -kal csökkent, összehasonlítva az SD csoport megfelelő súlyaival. A három csoport között azonban nem találtak különbséget a szív és a vese testtömeg-százalékában.

Az étrend hatása a szerv és a fehér zsírszövet tömegének abszolút tömegére, valamint az összes szerv és szövet súlyára normalizált testtömegre (%) egerekben 12 hét után SD (23,5% fehérje), HFD (16% fehérje) ad libitum fogyasztása után )) vagy HPD (60% fehérje). Valamennyi értéket átlag ± SEM-ként adunk meg, n = 10 az összes csoportra. Statisztikailag szignifikáns: * P * * P * * * P a, b P 3 A). Ez a megállapítás összhangban állt a HPD-vel táplált állatok alacsonyabb zsírtartalmával, összehasonlítva az SD- és HFD-táplált csoportokkal. Ezek az eredmények azt jelzik, hogy a HPD megakadályozta a zsír felhalmozódását a májban, és ez csökkentheti a zsírpárnák hipertrófiáját. Ezenkívül az étrend zsírmáj pontszámokra gyakorolt hatásának meghatározásához (3. B ábra) értékeltük az RWAT (3. C ábra) és az EWAT (3. ábra D) zsírsejtek méretét. Ezek az eredmények azt jelzik, hogy a három csoport között jelentős különbségek voltak. Megállapítottuk, hogy a HPD-vel táplált egerek zsírmáj pontszáma tízszeres, és háromszoros csökkenést mutat, összehasonlítva a HFD-vel és SD-vel táplált egerekkel. Az átlagos adipocita méret expressziós szintje feltárta, hogy a HPD-vel táplált egerekben az adipocyták következetesen kisebbek voltak, mint a HFD-vel táplált csoportban, a retroperitoneális és az epididymális zsírpárnák méretének átlagos csökkenése 86, illetve 85% volt. Ezenkívül az RWAT és az EWAT adipociták mérete a HPD-vel táplált csoportban szintén kisebb volt, mint az SD-vel táplált csoportban, átlagosan 53, illetve 33% -kal. Így a HPD nagyobb megelőző hatással volt a zsírsejtek hipertrófiájára, mint az SD.

Haematoxylinnel és eozinnal festett (A) máj-, retroperitoneális és epididymális fehér zsírszövetminták mikromográfiái, (B) zsírmájértékek, (R) RWAT adipocita cellularitása és EWAT (D) adipocita cellularitás 12 hét ad libitum fogyasztása után SD (23,5% fehérje), HFD (16% fehérje) vagy HPD (60% fehérje). Az összes értéket átlag ± SEM értékként adjuk meg, n = 9–11 az összes csoportra. Minden fotomikrográfot nagyításként határoztunk meg a szövettani elemzéshez (× 400). Statisztikailag szignifikáns: * P * * P * * * P 4 A). Figyelemre méltó, hogy a glükóz tolerancia és a vércukorszint 0, 30, 60 és 120 percnél szignifikáns volt (P 4 B). A glükóz intolerancia kritériumának alkalmazása 900 mg · L-1 feletti vércukorszintként az i.p. után 120 percnél. glükózinjekcióval azt tapasztaltuk, hogy a HPD-n és SD-n lévő egerek jelentős része alacsonyabb glükóz-intoleranciát mutat, mint a HFD-vel táplált egerek (P 4 C). A szérum inzulin koncentrációja szignifikáns különbséget mutatott a három csoport között. A HPD-vel táplált egerek inzulinszintje alacsonyabb volt, mint a HFD-vel táplált (P 4 D). Így a HPD-vel táplált egerek normális glükóz homeosztázist mutattak ki hypoinsulinaemiával.

A diéta hatása az (A) glükóz tolerancia tesztre: 1 g · kg -1 glükóz, (B) AUC a glükóz injekció utáni 120 perc alatt, (C) a glükóz intolerancia kritériuma (Fisher pontos tesztje) és (D) a szérum inzulin egerek szintje 12 hét után SD (23,5% fehérje), HFD (16% fehérje) vagy HPD (60% fehérje) ad libitum fogyasztása után. Valamennyi értéket átlagként ± SEM adunk meg, n = 10 az összes csoportra. * P * * P * * * P ### P 5 A). A rapamicin beadása szignifikáns (P 5 B) eredményt adott. A glükóz intolerancia kritériumának alkalmazása 900 mg · L −1 feletti vércukorszintként az i.p. után 120 perccel. glükózinjekcióval azt tapasztaltuk, hogy a rapamicinnel kezelt egerek jelentős része glükóz intoleranciát mutatott (P 5 C). A rapamicinnel kezelt egerek szérum inzulinszintje azonban magasabb volt (P 5 D). Tehát a rapamicint kapó sovány egereknél cukorbetegség tünetei jelentkeztek, hiperglikémia, hiperinszulinémia és glükóz intolerancia.

A rapamicin hatása az (A) glükóz tolerancia tesztre: 1 g · kg -1 glükóz, (B) AUC a glükóz injekció utáni 120 perc alatt, (C) a glükóz intolerancia kritériuma (Fisher pontos teszt) és (D) a szérum inzulin a szintet 35 napig vivőanyaggal vagy rapamicinnel kezelt sovány egereknél mértük. Valamennyi értéket átlagként ± SEM adunk meg, n = 12 az összes csoportra. * P * * * P 6 A), illetve inzulinérzékenységi index (6. B ábra). Annak további jellemzésére, hogy miként csökken a glükóz transzport az mTOR gátlása után, értékeltük a rapamicin hatását a glükóz transzporter expressziójára. A kontroll csoporthoz képest a rapamicin-kezelés drámai módon (P 389), amelyet az mTOR aktivitás specifikus markerként alkalmaznak, és amelyet patológiásan jellemez a cukorbetegség kialakulásában (Dann és mtsai, 2007; Chang és mtsai, 2009b). Azt is megállapítottuk, hogy az izomban a GLUT4 expresszió szignifikánsan (P 6 C).

Az adatokat átlag ± SEM formában mutatjuk be. Statisztikailag szignifikáns a