Az időben korlátozott etetés elnyomja a patkányokban a felesleges szacharóz által kiváltott plazma- és májlipid-felhalmozódást

Szerepek Konceptualizálás, Adatkezelés, Írás - eredeti vázlat, Írás - áttekintés és szerkesztés

Táplálkozási biokémiai laboratórium, Nagoya Egyetem, Nagoya, Japán

Szerepek Adatmegőrzés, írás - áttekintés és szerkesztés

Táplálkozástudományi tagozat, Nagoya Művészeti és Tudományi Egyetem, Nisshin, Japán

Szerepek Az adatok kezelése

Jelenlegi cím: Beppu Egyetem, Élelmiszertudományi és Táplálkozástudományi Kar, Beppu, Japán

Tagság Oita Egyetem Oktatási és Jóléti Tudományi Kar, Japán

Szerepek Az adatok kezelése

Táplálkozástudományi tagozat, Nagoya Művészeti és Tudományi Egyetem, Nisshin, Japán

Szerepek Az adatok kezelése

Tagság Oita Egyetem Oktatási és Jóléti Tudományi Kar, Oita, Japán

Szerepek konceptualizálás, adatkezelés, forrásszerzés, írás - áttekintés és szerkesztés

Táplálkozási biokémiai laboratórium, Nagoya Egyetem, Nagoya, Japán

Shumin Sun.,
Fumiaki Hanzawa,
Umeki Miki,
Saiko Ikeda,
Satoshi Mochizuki,
Hiroaki Oda

Ábrák

Absztrakt

Idézet: Sun S, Hanzawa F, Umeki M, Ikeda S, Mochizuki S, Oda H (2018) Az időkorlátozott etetés elnyomja a patkányokban a felesleges szacharóz által kiváltott plazma- és májlipid-felhalmozódást. PLoS ONE 13 (8): e0201261. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0201261

Szerkesztő: Marcia B. Aguila, Universidade do Estado do Rio de Janeiro, BRAZIL

Fogadott: 2018. április 26 .; Elfogadott: 2018. július 11 .; Közzétett: 2018. augusztus 15

Adatok elérhetősége: Minden releváns adat megtalálható a dokumentumban és a kiegészítő információkat tartalmazó fájlokban.

Finanszírozás: Ezt a munkát a Japán Tudományos Támogató Társaság tudományos kutatási támogatásai támogatják (http://www.jsps.go.jp/english/) (Címzett: HO; No.21658052; No.25292069; 16H04922). A finanszírozóknak nem volt szerepük a tanulmányok tervezésében, adatgyűjtésben és elemzésben, a közzétételre vonatkozó döntésben vagy a kézirat elkészítésében.

Versenyző érdeklődési körök: A szerzők kijelentették, hogy nincsenek versengő érdekek.

Bevezetés

További vizsgálatokra van szükség annak feltárásához, hogy a szacharóz hogyan járulhat hozzá a metabolikus szindróma kialakulásához molekuláris szinten. Jelenleg a szacharóz által kiváltott metabolikus szindróma hatékony megelőzésére vagy enyhítésére van szükség. Korábban bebizonyítottuk, hogy az elnyomott etetési ütemterv, 6 óránként magas koleszterinszintű étrend mellett, hiperkoleszterinémiát és zavart májórát eredményez patkányokban [11]. A cirkadián oszcillációk megszakadása az Clock mutáns egerekben az etetési ritmus és a metabolikus szindróma erőteljes csillapításához vezet [12]. Ezenkívül a magas zsírtartalmú étrend napi 8 órás, időben korlátozott táplálása egerekben javította az anyagcsere ritmusát és védelmet nyújtott az anyagcsere-betegségek ellen, ezáltal kiemelve mind a tápanyag-állapot, mind az etetési minta fontosságát az anyagcsere-homeosztázisban [13]. Ezenkívül igazolták az egerek modelljeiben a korlátozott időtartamú táplálkozási rend jótékony hatásait különböző étrend-körülmények között, beleértve a magas zsírtartalmú, magas fruktózszintű és magas zsírtartalmú és magas fruktóz tartalmú étrendeket is [14].

Időkorlátos táplálási rend az elhízás Zucker patkány modelljeiben, normál chow étrenddel, sikerült csökkenteni a testtömeg-növekedést [15]. Itt, annak érdekében, hogy értékeljük az időkorlátos etetés hatásait a szacharóz által kiváltott metabolikus szindróma enyhítésére genetikailag normális patkányokban, például rendellenes lipid-anyagcserét, létrehoztunk egy etetési ütemtervet a magas szacharóz-étrend (HSD) 12 órás korlátozásával hím Wistar patkányok aktív fázisa. A patkányok megfelelőbb állatmodellek lehetnek, mint az egerek az emberi anyagcsere-betegségek kivizsgálására, az egerekéhez viszonyított körülbelül 10-szer nagyobb testméret és stabilabb energia-anyagcsere-állapot miatt. Megállapítottuk, hogy a HSD időbeli korlátozással történő táplálása hatékonyan elnyomta a szacharóz által kiváltott lipidfelhalmozódást mind a vérben, mind a májban, összehasonlítva a HSD-vel etetett patkányokkal, anélkül, hogy jelentősen megváltoztatta volna a máj óragén expressziójának cirkadián oszcillációit.

Anyagok és metódusok

Állatok, etetési ütemterv és étrend

ZT: zeitigeber idő.

Biokémiai elemzés

A vér triglicerid-, koleszterin-, glükóz-, nem észterezett zsírsav- (NEFA) és epesav-koncentrációit kereskedelmi kitek (triglicerid E-teszt, T-koleszterin E-teszt, glükóz CII-teszt, NEFA-C teszt és TBA-) felhasználásával mértük. teszt; Wako Pure Chemical Industries, Oszaka, Japán). Az inzulin és a kortikoszteron szintjét ELISA készletek (patkány inzulin ELISA készlet, Morinaga Institute of Biological Science, Yokohama, Japán; kortikoszteron ELISA kit, Enzo life sciences, NY) alkalmazásával határozták meg.

Körülbelül 2,5 g májat homogenizáltunk és lipideket extraháltunk Folch és munkatársai által leírt módszer szerint. [16]. A máj összes lipidjét gravimetriásan határoztuk meg. A kivonatokban a máj trigliceridek, a koleszterin és a foszfolipid koncentrációit kereskedelmi készletekkel mértük (foszfolipidek C-teszt: Wako Pure Chemical Industries, Osaka, Japán).

A génexpresszió elemzése

A teljes RNS-t minden patkány 500 mg májszövetéből extraháltuk Chomczynski és Sacchi módszerével [17]. Az RNS minőségét északi blottolással igazoltuk. A dezoxiribonukleáz (DNáz) kezelést ribonukleáz (RNáz) mentes DNázzal (Promega, Wisconsin) és RNáz inhibitorral (Takara Bio, Japán) végeztük. A kiegészítő DNS-t (cDNS) 2 μg DNázzal kezelt RNS-sel szintetizáltuk reverz transzkripciós készlet segítségével (Nagy kapacitású RNS-cDNS készlet, Applied Biosystems, CA). A cDNS-t használtuk a messenger RNS (mRNS) szintjének meghatározására kvantitatív valós idejű polimeráz láncreakció (valós idejű PCR) analízissel. Ebben a vizsgálatban semmilyen kezelés nem befolyásolta az APOE mRNS szintjét, és normalizációs standardként használták. A felhasznált példakészletek sorrendjét az S1 táblázat mutatja.

Testhőmérséklet elemzés

A patkány testhőmérsékletét 10 percenként regisztráltuk a 0. naptól a kísérlet végéig. Az Rh Manager programot (KN laboratóriumok, Oszaka, Japán) a testhőmérséklet-változások elemzésére használták. Bár a variációkat 10 percenként követtük nyomon, az eredményeket 90 percenként figyeltük meg.

Statisztika

A kísérlet végén a nap folyamán mintákat gyűjtöttünk a szérumparaméterek és a máj génexpressziójának napi változásainak értékelésére. A táblázatokban és ábrákon megjelenített adatok az átlagot ± az átlag standard hibáját (SEM) jelentik. A testtömeg-növekedést, a táplálékfelvételt, a májtömeget, az epididymális zsírszövet súlyát, a máj lipidjeit, a szérumparamétereket és a valós idejű PCR eredményeket kétirányú ANOVA-val elemeztük. A plazma paramétereket kétirányú, ismételt ANOVA mérésekkel elemeztük. A testhőmérséklet-változásokhoz kétirányú ismételt ANOVA-méréseket követtek JTK_CYCLE-analízissel [18] az egyes patkányok fázisainak és amplitúdóinak meghatározásához. Végül a kétirányú ANOVA-t hajtották végre a fázisok és amplitúdók elemzésére négy csoport között. A táplálékfelvétel százalékát a világos (vagy sötét) periódusban Student's t tesztjével elemeztük. A statisztikai eredményeket a 2. táblázat és az S2 - S6 táblázatok mutatják be. Minden statisztikai elemzést az IBM SPSS Statistics (22. verzió) és az R studio segítségével végeztünk.

Eredmények

Testtömeg, táplálékfelvétel és szöveti súly

A testtömeg-növekedésnek nem volt nyilvánvaló változása a CDA, a HSDA és a HSDR csoportok között, míg a CDR csoport csökkent testtömeg-növekedést mutatott (2. táblázat). A teljes táplálékfelvétel a négy csoport között nem változott (2. táblázat). A CDA és a HSDA csoportok között azonban megváltozott a nappali/éjszakai táplálékfelvételi arány. Mivel a patkányok éjszakai állatok, táplálékuk nagy része a sötét időszakban történik (ZT12-ZT24) (2A. Ábra). Megmértük a világos-sötét periódusú táplálékfelvételi arányt az ad lib táplált csoportok számára. (2. ábra). Bár a HSDA patkányok megközelítőleg hasonló táplálékbevitelt mutattak, mint a CDA patkányok (2. táblázat), utóbbiak az inaktív fázisban (fényidőszak) teljesítették a napi táplálék 24% -át, míg a HSDA patkányok ekkor csak 17% -ot tartalmaztak (2B. Ábra). Ez az eredmény jelezte a HSD potenciális szerepét a patkányok napi táplálkozási ritmusának megváltoztatásában. A teljes táplálékbevitel nem mutatott szignifikáns különbséget az időkorlátos táplálás és az ad lib között. patkányok etetése (2. táblázat), ami azt jelzi, hogy az etetési rend nem változtatta meg a táplálék mennyiségét. A patkányok HSD-vel etettek, vagy ad lib. vagy időbeli korlátozásként nyilvánvalóan megnövekedett májtömeg jelenik meg (2. táblázat). Az epididymális zsírszövet súlya azonban nem különbözött a csoportok között (2. táblázat).

(A) A táplálékfelvételt világos/sötét periódusban d18-tól d20-ig mértük, és az időben korlátozott táplálékkal ellátott patkányok könnyű időszakokban nem jutottak táplálékhoz. Az értékek átlagok ± SEM, n = 20. A sötét periódus táplálékfelvételét kétirányú ANOVA-val elemeztük. A 0,05 a szignifikáns változásokat jelenti, az NS pedig nem szignifikáns. A fényidő táplálékfelvételét Student t tesztjével elemeztük, és *** azt mutatta, hogy az érték jelentősen eltér egymástól (p 3. ábra. A HSD időbeli korlátozással történő táplálása befolyásolta a patkányok testhőmérsékletének oszcillációs mintázatát.

A testhőmérsékleteket 10 percenként regisztráltuk a teljes 4 hetes vizsgálat során, és itt az utolsó két kísérleti napon 90 percenként átlagoltuk. Az értékek átlag ± SEM. Először kétirányú, ismételt méréseket végeztünk a testhőmérséklet ANOVA-jával minden két csoport és 4 csoport között. JTK_cycle analízist alkalmaztunk a testhőmérséklet fázisainak és amplitúdójának meghatározásához minden patkánynál (az egyes csoportok átlag ± SEM értékét az S2 táblázatban mutatjuk be). Ezután kétirányú ANOVA-t hajtottak végre a fázis és az amplitúdó elemzésére négy csoport között. A JTK_cycle és a kétirányú ANOVA statisztikai eredményei megtalálhatók az S2 táblázatban. A 0,05 a szignifikáns változásokat jelenti, az NS pedig nem szignifikáns. (A) Kontroll keményítő étrend ad lib. (CDA, n = 4 minden adatpontra) és magas szacharóztartalmú étrend ad lib. (HSDA, n = 3 minden adatpontra). (B) Kontroll keményítő étrend ad lib. (CDA, n = 4 minden adatpontnál) és a kontroll keményítő étrend korlátozott időtartamú etetése (CDR, n = 4 minden adatpontnál). (C) Magas szacharóztartalmú étrend ad lib. (HSDA, n = 3 minden adatpontra) és magas szacharóztartalmú étrend korlátozott időtartamú táplálás (HSDR, n = 3 minden adatpontra).

A vér paraméterei és a máj lipidjei

Annak megállapításához, hogy a HSD időbeli korlátozással történő táplálása megakadályozza-e a hiperlipidémiát patkányokban, mértük a plazma triglicerid és koleszterin szintjét. Megállapították, hogy a plazma trigliceridek szintje a következő négy hétben folyamatosan emelkedett az összes patkányban, és a HSD szignifikánsan megemelte a CDR patkányokhoz képest (4A. És S3. Ábra). Bár a HSD időbeli korlátozással történő táplálása egyértelműen gyengítette a trigliceridek növekedését, a CD-csoportokhoz képest magasabb szinten maradtak (4A. Ábra és S3 táblázat). A teljes koleszterin koncentráció a HSD csoportokban megemelkedett, amint azt a 4B. Ábra mutatja. Míg a CD időbeli korlátozással történő etetése jelentősen csökkentette a koleszterinszintet, a HSDR patkányok nem mutattak szignifikáns csökkenést (4B. És S3. Ábra). A plazma glükózszintjét nem befolyásolta a HSD, ad lib-vel táplálva. vagy időben korlátozott módon, a teljes kísérleti időszak alatt (4C. ábra és S3 táblázat).

A 0., 1., 3., 7., 14. és 24. napon mért plazma trigliceridek (A), koleszterin (B) és glükóz (C) változásait mutatjuk be. Az értékek átlagok ± SEM, n = 20. Az ANOVA kétirányú ismétlődő mérések statisztikai eredményeit az S3 táblázat tartalmazza. A 0,05 a szignifikáns változásokat jelenti, az NS pedig nem szignifikáns.

Ezután megmértük az inzulin, a kortikoszteron, a nem észterezett zsírsav (NEFA) és az epesavak napi változásait. A szérumot öt különböző időpontban gyűjtöttük össze (a vért gyűjtöttük, amikor patkányokat áldoztunk fel) az utolsó napig. Az inzulin reagál a szénhidrát-lipid anyagcserére, valamint a glükokortikoid hormonra, a kortikoszteronra (kortizol emberben), amelynek szerepe van a cirkadián oszcillációiban és a lipid anyagcserében [19–22]. Az inzulinszint csökkent a HSD csoportokban a ZT18 és ZT22 csoportokban. És a ZT8-nál a CDA patkányok magasabb inzulinszintet mutattak, mint a CDR és a HSDA (5A. Ábra). A kortikoszteron nem mutatott szignifikáns különbséget a csoportok között (5B. Ábra). A ZT18-nál a NEFA-t a HSD növelte, és szignifikánsan elnyomta a HSDR patkányokban (5.C ábra). A HSD az inaktív fázisban (fényperiódus, ZT2 és ZT8 esetén) szignifikánsan megemelte a szérum epesavszintjét (5D. Ábra), bár az időben korlátozott táplálás nem változtatta meg a HSD által kiváltott epesavszint emelkedést.

A kísérlet végén a vérinzulin (A), a kortikoszteron (B), a nem észterezett zsírsav (NEFA) (C) és az epesavak (D) napi változásait mutatjuk be. Az értékek átlag ± SEM, n = 4 minden adatpontnál. A kétirányú ANOVA statisztikai eredményeit az S4 táblázat tartalmazza. A 0,05 a szignifikáns változásokat jelenti, az NS pedig nem szignifikáns. Ha a kölcsönhatás szignifikáns, akkor a maradék átlag négyzetet használó Student-féle t tesztet hajtottuk végre: *** jelezte, hogy az értékek jelentősen eltérnek (p ### azt jelzi, hogy az értékek jelentősen eltérnek (p §§§ jelezte, hogy az értékek eltérnek) szignifikánsan (p ¶¶¶ jelezte, hogy az értékek szignifikánsan eltérnek egymástól (p 6. ábra. Időkorlátos táplálási rend elnyomta a HSD által kiváltott máj lipid felhalmozódást).

A máj összes lipidjének (A), trigliceridjeinek (B), koleszterinjének (C) és foszfolipidjeinek (D) mennyiségét mutatjuk be. Az értékek átlagok ± SEM, n = 20. A kétirányú ANOVA eredmények táblázataiban 0,05 jelent szignifikáns változást, az NS pedig nem szignifikáns. Ha az interakció szignifikáns, a Student-féle t-tesztet a maradék átlag négyzet alkalmazásával hajtottuk végre: *** jelezte, hogy az érték jelentősen eltér (p ### azt jelezte, hogy az érték jelentősen eltér (p. 7. ábra. A HSD ritkán befolyásolta a májóra gének expresszióját.

Az óragének CLOCK (A), BMAL1 (B), PER1/2 (C és D), CRY1 (E) REV-ERBα (F), DEC1 (G) és DBP (H) cirkadián oszcillációi az APOE-hez viszonyítva mRNS szint. Az értékek átlag ± SEM, n = 4 minden adatpontnál. Az egyes gének átlagos értékét ZT2-nél CDA patkányokban 100-nak határoztuk meg. A kétirányú ANOVA statisztikai eredményeit az S5 táblázat tartalmazza. A 0,05 a szignifikáns változásokat jelenti, az NS pedig nem szignifikáns.

A lipid-anyagcserét köztudottan főleg számos transzkripciós faktor szabályozza, mint például a SREBP (szterinszabályozó elemet megkötő fehérje 1/2), ChREBP (szénhidrát-válasz elemet megkötő fehérje), LXRα (1. nukleáris receptor alcsalád, H csoport, 3. tag), és a PPARα (1. nukleáris receptor alcsalád, C csoport, 1. tag) [25,26], amelyekről szintén beszámolnak, hogy cirkadián oszcillációt mutatnak [27–29]. Feltételeztük, hogy ezeket a transzkripciós faktorokat a HSD és az időkorlátos táplálás is befolyásolná, mivel a HSD által kiváltott máj lipidfelhalmozódást egyértelműen enyhítette az időkorlátozott táplálási rend (6. ábra). Ezen transzkripciós faktor gének expresszióját azonban alig befolyásolta a HSD vagy az időkorlátos táplálás, és mind a négy csoport hasonló expressziós mintázatot mutatott (8. ábra). Ez azt jelezte, hogy a HSD által kiváltott kóros lipid felhalmozódás májban és vérben történő csillapítása az időkorlátozott táplálékkal valószínűleg független a lipid anyagcserét közvetítő cirkadián oszcillációs-transzkripciós faktorok útjától.

Az SREBP1/2 (A és B), a ChREBP (C), az LXRa (D) és a PPARa (E) transzkripciós faktor gének cirkadián oszcillációit mutatjuk be az APOE mRNS szintjéhez viszonyítva. Az értékek átlag ± SEM, n = 4 minden adatpontnál. Az egyes gének átlagos értékét ZT2-nél CDA patkányokban 100-nak határoztuk meg. A kétirányú ANOVA statisztikai eredményeit az S6 táblázat tartalmazza. A 0,05 a szignifikáns változásokat jelenti, az NS pedig nem szignifikáns.

Vita

A metabolikus szindróma jelenleg meglehetősen elterjedt az étrend általános változása miatt a természetes táplálékról a magas zsírtartalmú, cukrot és sót tartalmazó feldolgozott élelmiszerekre [2]. A túlzott szacharóz a közelmúltban feltételezhető, hogy fontos szerepet játszik a metabolikus szindrómában [4,5,30]. A szacharózfeleslegről beszámoltak arról, hogy patkányokban túlzott energiafogyasztástól független elhízást és zsírmájat indukál, felgyorsítva a metabolikus szindróma jellemzőit [30]. Az elhízás okozta inzulinrezisztencia, amely az alkoholmentes zsírmájbetegséget (NAFLD) okozza, a metabolikus szindróma gyakori kórokozója [31]. A NAFLD kritikus szerepet játszik a metabolikus szindróma kialakulásában. Négy hetes vizsgálatunk során a HSD drámai módon megnövelte a lipidfelhalmozódást mind a vérben, mind a májban, ami a zsírmáj patogenezisére utal. A HSD időben korlátozott táplálása, csak aktív fázisban, gyakorlatilag elnyomta a fokozott lipidlerakódást, a zsírmáj fejlődésének javulását mutatta.

Megjegyzendő, hogy a testhőmérséklet emelkedése késett a sötét periódus (aktív fázis) kezdetén az időben korlátozott táplálkozású patkányokban (3. ábra és S2 táblázat). A testhőmérséklet általában 37–39 ° C között ingadozik emlősökben a hipotalamusz ellenőrzése alatt; A testhőmérséklet napi változásai összefüggenek az energia-anyagcsere rezgéseivel [46]. Feltételeztük, hogy a HSDR patkányoknál nagyobb az energiafelhasználás, mivel az időkorlátos táplálási rend gyengítette a HSD által kiváltott lipid felhalmozódást. A HSDR patkányok azonban a testhőmérséklet hasonló amplitúdójúak voltak, mint a HSDA patkányok. Bár az étrend és az időzítés nem gyakorolt szignifikáns interakciós hatást a fázisokra (S2 táblázat), a HSDR patkányok hajlamosak voltak késleltetni a testhőmérséklet emelkedését a sötét periódus kezdetén (3C. Ábra). Bár ez a késés nem magyarázta a vérben és a májban a lipid felhalmozódásának elnyomását, ennek a késésnek a lipid anyagcserében játszott lehetséges szerepe még nem fedezhető fel.

A metabolikus szindróma fő okozó tényezőjeként a szacharózfelesleg feleslegét ismerték el [4,5,30]. A HSD időkorlátos táplálási rendje az aktív fázisban hatékony és praktikus módszer a HSD által kiváltott káros hatások, különösen annak zsírmájra gyakorolt hatásának csillapítására. Az időkorlátos etetési beavatkozás számos állatnál sikeres volt, beleértve a Zucker elhízott patkányokat [15], az egereket [13,14,48] és az embereket [49], különféle étrendekkel. A legtöbb diéta- és táplálkozási beavatkozáshoz képest az étrend által kiváltott anyagcsere-betegségek kezelésében, amelyek a mennyiség csökkentésére és az energiafogyasztás korlátozására összpontosítanak, az időbeli korlátozású táplálkozási rendszerek váltak előnyös beavatkozási stratégiává. A HSD időbeli korlátozással végzett etetésének vizsgálata Wistar patkányokon 12 órás aktív fázison belül szintén új bizonyítékot állít fel ezen időbeli korlátozású etetési rend megvalósításáról.